洗車河霉豆腐加工及優良毛霉菌種的篩選

丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆碩，麻成金

（吉首大學食品科學研究所，湖南吉首 416000）

洗車河霉豆腐加工及優良毛霉菌種的篩選

丁宏武，彭彰文，彭珍珍，余兆碩，*麻成金

（吉首大學食品科學研究所，湖南吉首 416000）

從洗車河霉豆腐中進行毛霉菌種的篩選，得到3株優勢菌株6，9，10號，其在28℃時生長茂盛且菌絲顏色呈白色，產蛋白酶活力高，并在霉豆腐后發酵期積累了一定的糖化酶和脂肪酶；在菌株培養72 h后菌體開始老化，酶活力開始下降。

霉豆腐；加工工藝；篩選；酶活力

0 引言

腐乳（Sufu）又稱霉豆腐，是深受我國消費者喜愛的一種傳統發酵豆制品。腐乳不僅含有大豆本身所有的多種生理活性物質，而且通過微生物發酵作用，將大豆的苦腥味、脹氣因子、抗營養因子等不足之處全部克服，同時產生多種具有香味的有機酸、醇、酯、氨基酸，以及硫胺素、核黃素、尼克酸、鈣和磷等營養成分[1]，并且不含膽固醇[2]。除此之外，腐乳含有的生理活性物質具有一定保健功能，發酵產生的核黃素含量比豆腐中含量高6～7倍[3]。

對于湖南來說，湘西龍山縣洗車河霉豆腐當數一絕。2003年7月，中央12頻道在《走玩湘西》節目中首次對其進行了特別報道。自此，味美、清香、可口、醇厚成為了洗車河霉豆腐的代名詞。2007年11月，洗車河霉豆腐榮獲中國湖南第九屆（國際）農博會金獎，并已被列入湘西自治州非物質文化遺產保護項目。

但是，洗車河霉豆腐仍采用傳統自然發酵的方式進行生產，不僅嚴重制約了其產業化發展，同時也存在著許多雜菌毒素感染的安全隱患。試驗挑選了洗車河霉豆腐發酵毛坯上的毛霉菌株進行分離篩選，以期為大規模生產提供技術支持與品質保障。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

龍山洗車河霉豆腐發酵毛坯上分離得到的菌株。

1.2 培養基

（1）馬鈴薯蔗糖培養基[4]。去皮馬鈴薯20 g，蔗糖2 g，瓊脂2 g，水100 mL，自然pH值，分裝，于121℃下滅菌30 min，備用。

（2）麩皮培養基。稱取麩皮90 g，水100 mL，自然pH值，適量裝入250 mL三角瓶中，于121℃下滅菌30 min，及時搖散，備用。

（3）斜面種子培養基。酵母膏7 g，磷酸二氫鉀1 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.5 g，硫酸鋅0.2 g，豆餅粉20 g，葡萄糖15 g，瓊脂10 g，pH值6.0，用蒸餾水煮沸溶解后定容至1 000 mL，分裝，于121℃下滅菌30 min，備用。

（4）酪蛋白（干酪素）瓊脂培養基。酪素的母液質量分數為4%，是將4 g干酪素溶解于30～35 mL 的0.1 mol/L NaOH水溶液中，水浴溶解20 min，待溶解完全后加入60～70℃熱水，稀釋到所需質量分數（即定容到100 mL），即得到母液質量分數為4%的酪素溶液。培養條件為pH值6.5～7.0，121℃，滅菌30 min（腐乳中毛霉菌株的初步篩選及其培菌期的生化變化）。

1.3 試驗儀器

101-2AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產品；HZFB200型電子天平，美國康州HZ電子有限公司產品；E-201-C型pH計，上海精科實業有限公司產品；WSL-2型比色計，上海昕瑞儀器儀表有限公司產品；YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊公司產品；HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠產品；KDN型系列自動凱氏定氮儀，浙江托普儀器有限公司產品；SPX-250B型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；VS-1300-U型超凈工作臺，上海喬躍電子有限公司產品。

1.4 工藝流程

新鮮豆腐→劃塊→豆腐坯→純種霉菌接種→培養→搓毛→食用鹽腌制→添加輔料后裝壇→后熟→成品。

1.4.1 前發酵操作要點

（1） 切塊。豆腐經濾水后，切塊時要厚薄均勻、富有彈性，無氣泡現象，一般切成2 cm見方的塊狀。

（2）接種培養。將切好塊的豆腐以1～3 cm的間距擺放在籠格上，用噴霧器均勻地噴灑含有培養基培養的毛霉菌懸浮液，然后放置于發酵室內進行培養，溫度控制在20～25℃。在接種24 h后應翻籠1次，調節上下溫差，補給空氣，使毛霉菌正常繁殖，以后間歇倒籠，以降低品溫，直至制曲成熟。

（3）搓毛。培養結束，長滿菌絲的毛坯要及時搓毛。搓毛是將長在豆腐坯表面的菌絲搓倒，使棉絮狀菌絲將豆腐坯包住，有利于保持產品的外形；同時，將塊與塊之間的菌絲搓斷，把連接的豆腐塊分開。

1.4.2 后發酵工藝

（1）腌坯。腌坯時，要分層加鹽，下層鹽少一些，向上逐層增加。其作用為使鹽分在豆腐中充分滲透，使菌絲與毛坯收縮，失水變硬，經后發酵不松散，呈味且防腐，使其緩慢水解，防止腐乳靡爛。

（2）加輔料裝壇。添加香辛料、米酒、茶葉、食用油等輔料，裝壇時不可裝得過緊，否則發酵不完全，中間有夾心；也不能裝歪，以免影響產品外觀。

（3）封口。封口是最后一道工序，也是一個關鍵性工序。封口時，先選好合適的壇蓋，再以鹽水密封；要嚴防漏氣，漏氣使酒精蒸發，不僅易染雜菌，使腐乳發霉變質，還會使霉豆腐風味大打折扣。

1.5 測定方法

1.5.1 菌種的分離純化

將長滿毛霉菌絲的腐乳坯制成1×10-1～1×10-6的菌懸液，并從1×10-3～1×10-6的稀釋液中取0.1 mL分別涂布到馬鈴薯蔗糖培養基上，且每個稀釋度做3次平行試驗，于28℃培養箱中恒溫培養48 h，再選取生長速度快、菌絲豐滿、表面顏色一致的毛霉單菌落，在選擇培養基上劃線分離，將透明圈最大的純種毛霉蛋白酶菌株接種到馬鈴薯蔗糖培養基上，于28℃培養箱中培養48 h，待長滿孢子后備用[5-6]。

1.5.2 菌種的活化

用接種環取分離出的毛霉菌株，接入新鮮的種子培養基中，置于28℃培養箱中培養48 h。

1.5.3 菌種的初篩

采用透明光圈法，將菌懸液點接入酪蛋白培養基中，于28℃培養箱中培養48 h后測定透明圈的直徑與菌落直徑的比值（Hc），以Hc值的大小比較蛋白酶活力的高低。

1.5.4 菌種的復篩

取0.5 mL菌懸液（孢子數為10個/mL），接入麩皮培養基中，搖勻后于28℃培養箱中培養48 h。取一定量的鮮曲，制備酸性、堿性及中性蛋白酶粗酶液后，測定其相應蛋白酶的活力。

1.5.5 蛋白酶粗酶液的制備

取上述培養基中物質放入錐形瓶中，加入100 mL無菌水，并搗碎培養物，同時分別加入20 mL的0.1 mol/L，pH值為2.6的乳酸-乳酸鈉緩沖液及0.1 mol/L，pH值為7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和0.05 mol/L，pH值為10.0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，在40℃水浴中浸提1 h，間斷攪拌，經濾紙過濾后即得到相應的酸性、中性和堿性蛋白酶粗酶液。

1.5.6 蛋白酶活力的測定

采用福林-酚法（SB/T 10317—1999），分別用相應的pH值（2.6，7.2，10.0） 緩沖液配置酪蛋白溶液作底物，測定酸性、中性及堿性蛋白酶活力的高低。定義在40℃條件下，每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需酶量為1個酶活單位。

1.5.7 樣品預處理

準確稱取腐乳樣品25 g，研磨后溶于200 mL蒸餾水中，煮沸幾分鐘且在此期間不停攪拌，冷卻后定容至250 mL，靜置6 h，每30 min振蕩1次，最后用多層紗布過濾，得10%清液。

1.5.8 蛋白質的測定

采用凱氏定氮法（GB 50095—2010），測定樣品可溶性蛋白質時，取定量的樣品清液進行測定。

1.5.9 氨基酸態氮的測定

采用甲醛滴定法（SB/T 10170—2007）測定。

1.5.10 總酸的測定

采用總酸度測定法（SB/T 10170—2007）測定。

2 結果分析

2.1 毛霉菌株的篩選

2.1.1 菌株的初篩

將龍山洗車河霉豆腐毛坯上發酵的毛霉菌株接種到選擇培養基上，于28℃下培養48 h，對目標毛霉進行多次分離純化，然后進行初篩，選出10株左右合適的毛霉菌株。

將毛霉菌株培養后測定各個菌株的Hc值，然后根據Hc值的大小進行篩選，從中選出6株菌種，在此基礎上再進行下一步討論。

各菌株Hc值的比較見表1。

表1 各菌株Hc值的比較

由表1可知，1，2，3號的Hc值最低，4，7，9號的Hc值最高，其余的較一般。根據Hc值選擇4，6，7，8，9，10號。

2.1.2 毛霉菌株的復篩

將上述所選的毛酶菌株于28℃下進行培養，定時觀察其生長情況。包括菌絲的表面狀態、菌落的高度、長勢以及菌落的顏色，根據其生長情況來篩選出適合的毛霉菌種進行培育，并經擴大培養后放于4～6℃進行保存。

培養期毛霉菌株生長情況的比較見表2。

根據表2可得，4，8號生長速度緩慢菌絲低矮；而6，9，10號生長速度較快且菌絲較高、長勢也好，菌落顏色都是呈純白色；7號的生長情況一般。故選擇6，9，10號作為優良菌種進行下一部分的出發菌種。

2.1.3 優勢菌種小型生產試驗

通過對照試驗來驗證所選出來的優勢菌種效果，將優勢菌種和原菌種各接種到腐乳毛坯上，于28℃下培養，觀察并比較毛霉的生長情況，測定相應的酶活力。

原菌種與優勢菌種在腐乳上的培養情況見表3。

2.1.4 優勢菌種培養期生理變化

（1）優勢菌株蛋白酶作用最適pH值比較。

表2 培養期毛霉菌株生長情況的比較

表3 原菌種與優勢菌種在腐乳上的培養情況

優勢菌種在酸性、中性和堿性條件下蛋白酶活力比較見圖1。

圖1 優勢菌種在酸性、中性和堿性條件下蛋白酶活力比較

由圖1可知，優勢菌種均以產中性蛋白酶為主，蛋白酶作用最適pH值為9.0左右。

（2）優勢菌株在培養期各酶活力比較。

圖2 不同培養期6，9，10號蛋白酶活力

不同培養期6，9，10號蛋白酶活力見圖2。

由圖2可知，9號產蛋白酶能力較其他2個菌株高，且3個菌株在72 h產酶能力達到最高，隨后隨著培養時間的增加有所降低。

2.2 優勢菌種培養期豆腐坯的主要變化

6 號菌株培養期豆腐坯變化見圖3，9號菌株培養期豆腐坯變化見圖4，10號菌株培養期豆腐坯變化見圖5。

圖3 6號菌株培養期豆腐坯變化

圖4 9號菌株培養期豆腐坯變化

由圖3～圖5可知，在接種12 h左右后豆腐坯中的水溶性蛋白質含量、氨基酸態氮以及總酸隨之增加，且在24 h左右酶活力達到高峰，但在48 h左右酶活力有所下降，水溶性蛋白質含量、氨基酸態氮含量以及總酸含量增長也隨之減緩。

圖5 10號菌株培養期豆腐坯變化

3 結論

從湖南龍山洗車河霉豆腐中分離得到的毛霉菌種，經篩選后得到3株優勢菌株6，9，10號。6，9，10號生長速度快，菌絲高度可達12 mm，且長勢茂密，顏色都呈純白色，最后選擇以上3個菌株作為優勢菌種進行豆腐坯試驗。

通過培養期的試驗和豆腐坯試驗的綜合研究，優勢菌株培養60 h左右在豆腐坯表面積累了大量的蛋白酶以及一定量的糖化酶和脂肪酶，在72 h后菌體開始出現老化現象，故其酶活力出現下降趨勢。試驗對洗車河霉豆腐中的優勢菌種進行了較好的篩選，便于后續低鹽優質霉豆腐的產品生產。

[1]劉亞，楊光影，吳悅，等.腐乳研究進展 [J].農產品加工（學刊），2013（12）：64-65.

[2]符曉靜，孫君社.微生物蛋白酶在腐乳生產中的應用研究進展 [J].食品科學，2005，26（S1）：121-124.

[3]范俊峰，李里特，張艷艷，等.傳統大豆發酵食品的生理功能 [J].食品科學，2005，26（1）：250-254.

[4]李璘佼，車振明，汪彬彬.腐乳中毛霉菌株的初步篩選及其培菌期的生化變化 [J].中國調味品，2010（9）：56-64.

[5]劉芳，曹新志，方春玉，等.腐乳毛霉蛋白酶菌株紫外線誘變育種 [J].生物技術，2009，19（5）：50-52.

[6]費國源，孫培龍.蛋白酶改性處理對小麥面筋蛋白溶解度和起泡性的影響 [J].農產品加工（學刊），2009（1）：32-34.

Processing Technology and Screening of Elite Strain for Sufu in Xichehe

DING Hongwu，PENG Zhangwen，PENG Zhenzhen，YU Zhaoshuo，*MA Chengjin （Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The experiment screenes three target strains from natural fermentation microorganism of Xichehe Sufu which are NO.6，NO.9 and NO.10.Under temperature of 28℃，the mycelia are prosperous with white color，producing high-active protease.The three strains accumulate a large number of saccharifying enzyme，lipase during cultivation，but after 72 hours，thalli become old with enzyme activity declining.

Sufu；processing technology；screening；enzymatic activity

TS214.2；TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.038

1671-9646（2016）11b-0034-04

2016-09-08

吉首大學食品與生物類專業大學生創新訓練中心資助項目（JDCX2015-13）。

丁宏武（1993—），男，在讀本科，研究方向為食品資源加工與利用。

*通訊作者：麻成金（1963—），男，碩士，教授，研究方向為食品資源加工與利用。