大竹蟶幼貝濾水率的響應面法分析

姜 北，董 穎，高 杉，王 擺，曹 琛，張 乾，郝詠芳，王永波，周遵春

( 1. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023； 2. 營口市水產科學研究所，遼寧 營口 115003；3. 營口現代漁業科技產業園，遼寧 營口 115001 )

大竹蟶幼貝濾水率的響應面法分析

姜 北1，董 穎1，高 杉1，王 擺1，曹 琛2，張 乾2，郝詠芳2，王永波3，周遵春1

( 1. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023； 2. 營口市水產科學研究所，遼寧 營口 115003；3. 營口現代漁業科技產業園，遼寧 營口 115001 )

采用三因素三水平中心組合試驗設計方案，研究光照度、鹽度、pH及三者交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響，并進行響應面分析，探尋大竹蟶幼貝最適生長條件組合，構造大竹蟶幼貝濾水率模型。試驗期為30 d，試驗光照梯度為2000 lx、1000 lx、0,鹽度梯度為30、25、20，pH梯度為9.00、8.00、7.00。結果顯示，光照度、鹽度及 pH 三者對大竹蟶幼貝濾水率有顯著交互作用(P<0.05)。通過Design-Expert 8.0軟件對數據進行二次多元回歸，擬合得到大竹蟶幼貝濾水率y對編碼自變量A(光照度)、B(鹽度)和C(pH)的二次多元回歸方程:y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821)，軟件模擬最適大竹蟶幼貝生長的條件組合為光照度1109.17 lx，鹽度25.12，pH 7.89。

大竹蟶；光照度；鹽度；pH；濾水率；響應面分析

大竹蟶(Solengrandis)屬軟體動物門、雙殼綱、異齒亞綱、簾蛤目、竹蟶科，主要分布于我國沿海潮間帶地區[1]，營埋棲生活，主要以海水中有機碎屑和微型浮游生物為食[2]。為有效保護和利用野生資源并滿足大竹蟶的市場需求，開展大竹蟶苗種規模化繁育及增殖放流工作勢在必行。

濾水率是濾食性雙殼貝類能量學的重要參數和生理指標，可用于推算海區貝類的養殖容量和生長余力。濾水率主要受溶解氧、溫度、鹽度、餌料豐度、酸堿度、沉積環境等多因素的影響[3]。國內外文獻報道主要通過溫度、鹽度、pH、餌料含量等單因素來考察雙殼貝類濾水率[4-7]，有關工廠化苗種繁育過程中，環境條件對于大竹蟶幼貝濾水能力的研究鮮見報道。

響應面法是一種解決多變量問題的數學統計分析方法，主要通過提供合理的試驗設計和數據統計分析、評價多種變量之間的交互作用而建立數學模型和三維立體響應曲面圖形，并最終得出最優參數組合的多元回歸方程[8]。目前響應面法在藥物開發、食品以及環境微生物等領域中的應用報道較多[9-14]，在水產動物尤其是貝類研究上應用較少。桑士田等[15]對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)生長環境條件進行優化分析，朱曉聞等[16]研究了溫度、鹽度和pH對馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)生長的作用，Robert等[17]指出當解釋變量較多時，只有研究多變量之間的交互作用才更有實際意義。筆者利用響應面法研究pH、鹽度、光照度三因素及其聯合效應對大竹蟶幼貝濾水率的影響，并利用多元回歸方程模擬大竹蟶幼貝最優生長環境條件，以期為大竹蟶養殖條件優化、工廠化人工苗種繁育和增殖放流提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大竹蟶幼貝取自營口市水產科學研究所貝類研發基地，選取當年同批、規格一致的健康苗種，隨機測量30個個體，平均殼長為(10.00±0.08) mm，洗凈表面的污物，在水槽中暫養7 d，連續充氣，每日等量(約3.0×105個/mL)投喂小球藻(Chlorella)、扁藻(Tetraselmischui)和鹽藻(Dunaliellasalina)的混合餌料并全量換水一次，海水溫度24 ℃，鹽度24，pH 7.9，光照度0～2000 lx，底質為4 cm厚泥沙，試驗前移入經500目篩絹和脫脂棉過濾的新鮮海水中饑餓3 d備用。

1.2 試驗方法

采用三因素三水平的中心組合試驗方案進行響應面分析，方案見表1、表2。

在避光條件下通過光度計和可調燈光控制光照梯度，用靜置淡水和天然海水按比例配制試驗所需鹽度，用氫氧化鈉和鹽酸調配pH。試驗容器為60 L水槽，每個水槽放置600個幼貝，設置3個平行組。所用海水提前3 d逐級微調配好鹽度和pH，穩定3 d后再進行試驗，試驗開始時投喂3.0×105個/mL的小球藻(預試驗得出此密度下濾水率最高)，2 h后測量各組濾水率。

表1 響應面三因素三水平試驗設計

表2 響應面分析方案與試驗結果

1.3 濾水率計算

懸浮顆粒有機物測定方法：將孔徑1.2 μm的GF/C玻璃纖維濾膜經450 ℃灼燒6 h，并標記稱量質量。取一定體積的水樣，用經上述烘干的GF/C玻璃纖維濾膜進行抽濾，用約10 mL甲酸銨(0.5 mol/L)漂洗掉濾膜上的鹽分，再經110 ℃烘干后電子分析天平稱量質量(m110)，最后經450 ℃灼燒6 h后稱量質量(m450)。

懸浮顆粒有機物含量=m110-m450

濾水率=V×ln(C0/Ct)/n·t

式中，濾水率指單位時間的平均濾水率[mL/(個·min)]，V為試驗容器體積(mL)，n為試驗個體數量，C0和Ct分別為試驗開始和t時間水體中懸浮顆粒有機物含量。

1.4 數據分析

使用SPSS 22.0和Design-expert 8.0軟件進行試驗設計和數據分析，以光照度(A)、鹽度(B)和pH(C)為自變量，濾水率(y)為應變量建立模型方程，并對濾水率的最佳條件進行預測和優化，回歸擬合大竹蟶幼貝濾水率模型曲線并做圖。

模型方程濾水率y=k+x1A +x2B+x3C+x4A×B +x5A×C+x6B×C+x7A2+x8B2+x9C2+ε。

式中,k為截距，x1、x2、x3分別為光照度、鹽度和pH的一次效應；x4、x5、x6分別為光照度、鹽度和pH之間的交互作用；x7、x8、x9分別為光照度、鹽度和pH之間的二次效應；ε為殘差，假定其服從均值為0的正態分布。

通過 ANOVA 分析確定回歸方程模型及各試驗因素的顯著性，給出決定系數以考察模型的擬合優度，模型中各項效應采用最小二乘法進行估計并采用F統計量進行顯著性檢驗，顯著水平設定為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與分析

2.1 光照、鹽度和pH交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響

利用 Design-Expert 8.0軟件對表 2 數據進行二次多元回歸擬合并得出二次回歸方程的等高線和響應面，光照和鹽度的交互作用以及光照和 pH的交互作用均對大竹蟶幼貝濾水率的影響明顯(圖1，圖2)，鹽度和pH的交互作用對大竹蟶幼貝濾水率影響不明顯(圖3)。隨著三因素的變化大竹蟶幼貝濾水率存在最佳范圍。

當光照度由0升至1000 lx時，濾水率達到最大，但當光照度繼續增至2000 lx時，濾水率逐漸下降；當鹽度由20升至25時，大竹蟶幼貝濾水率逐漸達到峰值，但當鹽度由25升至30時，濾水率開始降低；pH由7.00升至8.00，濾水率逐漸增加到峰值，當pH 由8.00升至9.00時，濾水率開始下降。因此，根據模型可以預測出大竹蟶幼貝的最適攝食條件為光照度1000 lx、鹽度25和pH 8.00。

圖1 光照度和鹽度交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響

圖2 光照度和pH交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響

圖3 鹽度和pH交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響

2.2 大竹蟶幼貝濾水率條件擬合優化

大竹蟶幼貝濾水率預測值y對編碼自變量 A(光照度)、B(鹽度) 和 C(pH)的二次多項回歸方程：

y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C+0.022AB-0.065AC-0.048BC-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9874，Adj r2=0.9713，pred r2=0.8472)；

大竹蟶幼貝濾水率預測值y對實際值自變量A、B和C的二次多項回歸方程：

y=-60.30975+0.00126025A+1.3835B+11.11075C+0.0000045AB-0.000065AC-0.0095BC-0.0000003845A2-0.02608B2-0.6845C2，回歸方程的方差分析結果見表 3。

表3 回歸模型的方差分析

注：r2=0.9874，Adj r2=0.9713，pred r2=0.8472，偏差系數=11.85%.

對F值、P值、r2、校正可決系數Adj r2、偏差系數進行分析，進而檢驗模型的顯著性，F值越大越好[18-19]。表3的方差分析結果表明,F值為61.14，P<0.0001，模型的決定系數為0.9874，說明該模型擬合效果較好，能解釋98.74%的變化，因此模型可以預測出3個因子在試驗設計范圍內的組合，但模型 pred r2與 Adj r2相差較大，說明模型可以進一步優化。偏差系數表示試驗的精確度，偏差系數越大，試驗的可靠性越低，本試驗的偏差系數僅為11.85%，說明試驗操作可信。

由方差分析可知，光照和pH 的一次效應影響顯著(P<0.05)，光照、鹽度、pH 的二次項對模型的影響極顯著(P<0.01)，但三因素間交互作用不顯著(P>0.05)，因此需要將交互作用項剔除并重新對模型進行回歸得到修正后大竹蟶幼貝濾水率預測值y對編碼自變量 A、B和C 的二次多項回歸方程：y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821，Adj r2=0.9713，pred r2=0.9363)，決定系數為0.9821，說明該模型能解釋98.21%的變化，Adj r2和pred r2相差不大，說明模型擬合度良好；修正后大竹蟶幼貝濾水率預測值y對實際值自變量 A、B 和 C 的二次多項回歸方程：y=-58.00225+0.00085275A+1.312B+10.80825C-0.0000003845A2-0.02608B2-0.6845C2，修正后的回歸模型的方差分析結果見表 4。

表4 修正后回歸模型的方差分析

注：r2=0.9821，Adj r2=0.9713，pred r2=0.9363，偏差系數=11.85%.

表4的單因子線性回歸結果表明,pH對大竹蟶幼貝濾水率的影響極顯著(P<0.01)，光照對濾水率產生顯著影響(P<0.05)，鹽度對濾水率無顯著影響(P>0.05)。3個因素的二次項能夠對濾水率產生極顯著影響(P<0.01)。因此，通過 Design-Expert軟件對大竹蟶幼貝最優生長條件進行分析預測并建立優化模型，得出三因素最優點(A，B，C)的代碼值為(0.109、0.03、-0.105)，即(1109.17 lx、25.12、7.89)。此時濾水率可以達到最大值1.63672 mL/(個·min)。

2.3 模型驗證

運用Design-Expert軟件構建的響應面模型得出的大竹蟶幼貝濾水率最優條件，選擇與試驗期間相隔一個月的同規格大竹蟶幼貝進行驗證試驗，試驗為期30 d，設計3個平行試驗組，試驗預測結果和實際驗證結果見表5。驗證結果表明響應面模型分析方法可靠。

表5 試驗結果驗證

3 討 論

3.1 光照度對大竹蟶幼貝濾水率的影響

光照可直接或間接影響水生生物的生理狀態和生活規律，同時水生生物攝食的晝夜節律現象也廣泛存在[20]。光照度影響貝類濾水率方面的研究較少，早在20世紀70年代Maru[21]發現，蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)幼貝攝食的晝夜規律明顯，光照時間和強度直接影響其濾水強度和時間，濾水率與光照度呈反比關系。杜美榮等[22]的研究指出，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)幼貝的濾水率同樣具有強烈的晝夜變化，白天濾水率較低，夜間具有較高的濾水率，晝夜差異顯著。有報道指出，縊蟶(Sinonovaculaconstrzcta)的攝食行為晝夜節律性明顯[23-24]。另外，據吳桂漢等[25]報道，菲律賓蛤仔幼貝夜間的攝食率明顯高于白晝，晝夜間攝食率差異顯著。

本研究結果表明，大竹蟶幼貝的濾水行為與光照度具有直接相關性。試驗期間的大竹蟶幼貝最大濾水率出現在光照度1100 lx時，最小濾水率出現在光照度0 lx和2000 lx時。雙殼貝類主要以浮游動植物和有機碎屑為食，而浮游植物的繁殖主要依靠光合作用[26]，雙殼貝類的視覺不發達，主要依靠外套膜上的色素細胞和外套眼進行感光[27]。因此，雙殼貝類攝食習性的晝夜差異很有可能是為了適應餌料生物的晝夜變化，是對光照度、溫度、潮汐等生態因子周期性變化的生態響應[22]。本研究中大竹蟶幼貝殼長約10 mm，其光感受器的發育接近于成貝，晝夜節律習性逐步形成。Holt等[20]也發現，硨磲(Tridacnidae)表面的虹彩細胞會根據光線的變化而調節參與“光合轉化”的效率，從而影響其自身的生長和攝食情況。但也有學者發現，有些貝類的攝食強度與晝夜變化無關[28]。

3.2 鹽度對大竹蟶幼貝濾水率的影響

鹽度對貝類在自然界中的分布起著決定性作用，生活在近岸海區潮間帶的貝類需要調節自我生理狀態以適應海水鹽度的周期性變化[29]。在適宜滲透壓和鹽度條件下，貝類攝食和濾水能力旺盛，此時產生的能量主要用于機體的新陳代謝[16]。鹽度主要通過改變滲透壓來影響貝類的濾水、附著、呼吸、心跳等生理活動。貝類會在外界鹽度劇烈變化時采取關閉貝殼或水管等方式降低機體與外界的水流交換，從而保護機體免受鹽度劇變帶來的傷害。貝類對鹽度變化的適應能力還與貝類規格、形態結構、生理狀態及生理調節機制密切相關[30-32]。Farmer等[33]研究發現，在適宜的鹽度范圍內，貝類主要通過調節體內游離氨基酸含量來適應外界環境滲透壓的改變，當外界鹽度超出貝類適宜范圍時，調節機制失效并導致死亡[34]。鹽度一次效應對濾水率的影響不顯著(P>0.05)，其原因可能是試驗鹽度超出適宜范圍或設計范圍過大，或者大竹蟶幼貝在此鹽度范圍內的滲透壓調節能力能夠滿足自身攝食和濾水需要。吳楊平等[35]報道中指出大竹蟶幼貝適鹽范圍為20～32。

本次試驗的鹽度一次效應對大竹蟶幼貝濾水率影響不顯著的原因可能是試驗所用幼貝為營口沿海土著大竹蟶的后代，親貝所在海區鹽度長期為25，并且幼貝從孵化到成熟都在此鹽度范圍內，已經得到鹽度馴化。鹽度的二次效應對大竹蟶幼貝濾水率具有極顯著影響(P<0.01)，說明最佳濾水率鹽度為20～30，表明大竹蟶幼貝在鹽度20～30時的代謝活動較強，其自然生活條件與這一鹽度水平相近。另外，光照和鹽度交互作用及鹽度和pH交互作用顯示出濾水率存在拐點，這與相關研究結果類似[15-16,36]。

3.3 pH對大竹蟶幼貝濾水率的影響

Bamber[37]的研究與本研究結果相似，pH對雙殼貝類的濾水率具有顯著影響，在適宜的pH范圍內具有較高濾水率[38]。栗志民等[39]發現，超出耐受閾值的pH會抑制鰓纖毛組織細胞正常生長和鰓纖毛的活力，過低的pH會麻痹貝類并使貝殼松弛，損壞貝類的正常攝食能力。此外，pH過低還會改變貝類生理學狀態，從而降低攝食和生長性能[40-42]。

本試驗結果顯示，pH的一次效應和二次效應均對大竹蟶幼貝濾水率的影響極顯著(P<0.01)，這與潘魯青等[6]在研究縊蟶濾水率時發現最佳濾水率出現在pH 7～9的研究結果一致。大竹蟶幼貝濾水率隨pH變化出現先升后降的趨勢，這與文蛤(Meretrixmeretrix)、劍狀矛蚌(Lanceolariagladiola)等貝類的研究結果相似[38-39]。pH在7和9時，大竹蟶濾水率均出現低值，說明過高或過低的pH均會對大竹蟶幼貝的攝食能力造成負面影響[43]。

3.4 光照度、鹽度和pH交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響

交互效應的強弱和大小由等高線形狀是否接近圓形來進行判別，橢圓形表示雙因素間具有交互作用，圓形表示雙因素間無交互作用。光照度和鹽度的交互作用及光照度和pH的交互作用的等高線接近橢圓，表示雙因素間的交互作用明顯；鹽度和pH的交互作用的等高線趨近圓形，表示雙因素間無交互作用或交互作用很弱。

鹽度和pH的交互作用對大竹蟶幼貝濾水率的影響不明顯，這可能與pH和鹽度的影響機制不同有關，pH是通過影響貝類體內蛋白水平而控制能量代謝，而鹽度是改變滲透壓來影響濾水能力，它們是兩個相互獨立的過程。Ginger等[44]的報道也指出，pH和鹽度的交互作用對太平洋牡蠣(Crassostreagigas)幼貝的生長影響不顯著。

光照度和 pH 的交互作用影響大竹蟶幼貝的濾水率，筆者認為，可能與pH在改變機體抗氧化酶活力和脂質過氧化作用的途徑有關，持續光照會直接影響水體溫度和二氧化碳含量。朱曉聞等[16]研究馬氏珠母貝幼貝的濾水率時發現，pH和溫度的聯合效應顯著影響幼貝濾水率。Matozzo等[45]研究雞簾蛤(Chameleagallina)和紫貽貝(Mytitidaegalloprovincialis)時發現,溫度和pH的聯合作用對雙殼貝類的抗氧化反應和脂質過氧化作用影響顯著，同時還發現,水體中二氧化碳的含量和pH的聯合作用也會影響貝類的酶活性。此外，光照通過海水中浮游植物的光合作用而間接改變海水中溶解氧和二氧化碳的含量，從而影響到海水的 pH。Sui等[46]報道，海水pH和溶解氧的交互作用會影響厚殼貽貝(M.coruscus)的攝食和生長，因此光照和 pH 之間存在著一定的間接關系。

光照和鹽度的交互作用對大竹蟶幼貝濾水率有一定影響，其原因可能為光照時間和強度會改變水體pH，從而改變水體中離子的濃度，而鹽度通過影響滲透壓而調節離子交換。有研究表明，隨著鹽度、pH的升高，貝類濾水率逐漸達到峰值，然后逐漸下降，這與本試驗的研究結果一致[38]。另外，光照會影響水體中溶解氧和CO2水平，已有報道指出，溶解氧和鹽度的交互作用會影響貝類的濾水率、吸收效率、呼吸率和生長率[47]。CO2和鹽度的協同作用會增加水體酸化趨勢，影響離子和酸堿比率以及貝類對海水酸化的自我修正機制[48]。

相關研究中，櫛孔扇貝幼貝的最適光照度約為1000 lx(凌晨)[22]，背角無齒蚌(Anodontawoodiana)的濾水率也具有一定的晝夜節律，最大濾水率出現在18:00(約1000 lx)[49]。包永波等[50]亦認為,溫度是貝類攝食率晝夜變化節律的主要原因，光照度為1000 lx時的溫度比較適宜，海水的黏滯性降低和貝類的側纖毛運動能力提高，攝食率也隨之升高；桑士田等[15]發現菲律賓蛤仔幼貝的最適鹽度為23.35，潘魯青等[6,25]認為,鹽度為22～30時,貝類的攝食率最高，鹽度低于22和高于30時,攝食率顯著下降；朱曉聞等[16]認為,馬氏珠母貝幼貝的最適 pH 為8.09。本試驗模型優化得出的大竹蟶幼貝濾水率的最佳組合為光照強度1109.17 lx、鹽度25.12、pH 7.89，基本符合海洋貝類的生長習性。

目前針對貝類濾水率的研究較少考察環境因素的聯合作用及二次效應。本試驗通過分析光照、鹽度和 pH的交互作用對大竹蟶幼貝濾水率極顯著(P<0.01)而構建的模型擬合度很高，說明該模型能夠很好的解釋大竹蟶幼貝濾水率隨環境因素的變化，可以用于預測實際生產。

此外，研究大竹蟶生長的最佳優化條件時還應進一步考慮餌料種類和密度、貝類密度和規格、底質條件、海水流速、溶氧水平、試驗時間等交互作用對濾水率的影響。

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OptimizationofFiltrationRateinJuvenileRazorClamSolengrandisbyResponseSurfaceMethodology

JIANG Bei1，DONG Ying1，GAO Shan1，WANG Bai1，CAO Chen2，ZHANG Qian2，HAO Yongfang2，WANG Yongbo3，ZHOU Zunchun1

( 1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023，China；2.Yingkou Fisheries Institute，Yingkou 115003，China；3. Yingkou Modern Fishery and Technology Industrial Park，Yingkou 115001，China )

The joint effects of illumination，salinity and pH on filtration rate of juvenile razor clamSolengrandiswere studied using Box-Behnken experimental design and response surface methodology ( RSM ) under laboratory conditions, aiming to quantifying the relationship between the filtration rate and the above three factors, and to the optimal factor combination through statistical optimization approach.The results showed that there were significant interaction effects between illumination and salinity, and between illumination and pH on the filtration rate of razor clam juveniles (P<0.05).The multivariate non-linear model is described asy=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821), the optimal conditions for filtration were found under conditions of illumination of 1109.17 lx, salinity of 25.12 and pH=7.89. The findings indicate that the proposed model is reasonably accurate and can be used for describing and predicting the growth features of juvenile razor clam in different environmental factors．

Solengrandis；illumination；salinity；pH；filtration rate；response surface methodology

S968.31

A

1003-1111(2016)04-0313-08

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.001

2016-01-05；

2016-03-10.

遼寧省海洋與漁業廳項目(201603，201301)；遼寧省科技計劃項目(2015103044).

姜北(1982—)，男，助理研究員；研究方向：海洋生態學．E-mail:jiangbei1983@163.com.通訊作者：周遵春(1967—)，男，研究員，博士；研究方向：海洋生物學．E-mail: zunchunz@hotmail.com.