烏龜鮑曼不動桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

丁 利,黎俊榆,代小梅,汪繼超,方振華,史海濤

( 1. 海南師范大學 生命科學學院，海南 海口 571158； 2. 海南職業技術學院 生物工程學院，海南 海口 570216 )

烏龜鮑曼不動桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

丁 利1,黎俊榆1,代小梅1,汪繼超1,方振華2,史海濤1

( 1. 海南師范大學 生命科學學院，海南 海口 571158； 2. 海南職業技術學院 生物工程學院，海南 海口 570216 )

自患病烏龜肝臟中分離出1株優勢菌DL01221，對其進行形態學觀察、生化試驗、16S rRNA基因序列分析，同時采用Kriby-Bauer紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。試驗結果表明，該菌為革蘭氏陰性球桿菌，將該菌株16S rRNA序列進行同源性和系統進化樹分析，發現它與鮑曼不動桿菌處于同一群，同源性超過98%，結合菌株形態和生化指標，確定該菌株為鮑曼不動桿菌。致病性試驗結果顯示，其對烏龜具有較強的致病作用；耐藥性結果顯示其對頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星敏感，對其他多種抗生素耐藥。

烏龜；鮑曼不動桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

近年來，隨著龜鱉養殖業的迅猛發展，養龜場規模在不斷擴大，龜類疾病也日益頻發，其中尤以細菌性和病毒性傳染病為甚[1-3]，常發生爆發性流行，死亡一般在15%左右，嚴重的可高達80%，甚至全軍覆滅，使養殖場遭受巨大的經濟損失，嚴重制約著龜鱉養殖產業的可持續發展[4]。目前鑒定病原種類是確診病因及對癥下藥的前提，但人們對龜類疾病的研究起步較晚，基礎理論研究和病原分離方法與技術落后，多數養殖場存在盲目用藥現象，給龜類養殖戶造成不必要的經濟損失。

細菌病是水生動物常發病。鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)作為重要條件致病菌引發的動物感染已被廣泛報道[5-6]，也有發現不動桿菌存在于患病的水生動物體內[7-8]，如感染鮑曼不動桿菌株后斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)死亡[7]。本研究自患病烏龜(Mauremysnigricans)體內分離出致病菌，通過培養特性、生化和分子生物學鑒定，判定分離菌為鮑曼不動桿菌；通過致病性研究發現該菌可引起烏龜發病；同時采用Kriby-Bauer紙片擴散法對分離菌株進行耐藥性分析，旨在為龜鱉的健康養殖提供參考依據，并為龜類養殖業細菌病害的防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

患病烏龜由海南省某龜鱉養殖場提供。病龜腹甲和背甲均有明顯的潰爛，頸部和四肢有大小不一的白點。剖解發現，發病龜肝、脾腫大，表面出血，質脆易碎，呈紫黑色，腹腔內有積液，惡臭。

1.1.2 主要試劑及儀器

革蘭氏染色試劑(杭州微生物試劑有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]；PCR試劑(Promega公司)；藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術開發公司)；生化鑒定試劑(廣東環凱微生物科技有限公司)；PCR儀及凝膠成像分析系統(BIORAD公司)；冷凍高速離心機(EPPENDORF公司)；生物安全柜(力康發展有限公司)；引物合成和測序均由上海生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化、鏡檢

病龜經低溫麻痹后，體表用75%的酒精消毒，迅速剖檢并分離肝臟，低溫條件下研磨后，用無菌生理鹽水進行稀釋，無菌接種于普通營養瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養18～24 h，再挑取單個菌落于無菌條件下進行劃線分離、培養，重復以上步驟，直至菌落特征相同時，再挑取單個菌落涂片，進行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌落形態及染色特點；將單菌落分別接種于麥康凱培養基和SS 瓊脂培養基進行選擇性培養，觀察菌落的生長情況。

1.2.2 生化試驗鑒定

將分離菌純培養物進行生化試驗，按文獻[9]方法進行。

1.2.3 16S rRNA的PCR擴增及序列分析

取適量的菌液離心收集菌體，采用SDS裂解法提取細菌DNA，按文獻[10]方法進行。采用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，引物序列為：

上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；

下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應體系如下：TaqMix 12.5 μL，去離子水8.5 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度均為10 pmol/L)，模板DNA 2 μL，共25 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 60 s，34個循環；72 ℃ 10 min；擴增產物依照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR擴增產物進行切膠回收，并送往上海生物工程技術服務有限公司測序。分離菌的16S rRNA基因序列通過美國國立生物技術信息中心NCBI的Blast檢索系統進行序列同源性分析，并構建系統進化樹。

1.2.4 人工感染試驗

將分離菌稀釋至密度為1.0×107cfu/mL的菌液，腹腔注射12只健康烏龜(10月齡，平均體質量為95 g/只)，每只0.5 mL，對照組12只烏龜注射0.65%等量生理鹽水，觀察14 d，統計發病率和死亡率。取肝臟、腎臟、脾臟組織進行細菌分離培養和鑒定。

1.2.5 藥物敏感性試驗

采用世界衛生組織推薦的紙片瓊脂擴散法即Kirby-Barere法，無菌條件下，將菌液均勻涂布于LB培養基，貼上臨床常用的動物疾病治療的藥敏紙片，將培養皿放于培養箱，37 ℃培養24 h后，測量各抑菌環直徑。依據說明書上“不動桿菌抑菌圈直徑判斷標準”判別試驗菌對所用抗生素的敏感程度。

2 結 果

2.1 細菌培養特征及形態

經分離所得的細菌，在普通營養瓊脂平板培養基上純化培養后，呈圓形乳白色、不透明、邊緣整齊、表面圓滑濕潤、中間微凸起的菌落(圖 1a)；在麥康凱平板上生長良好，呈圓形、表面濕潤光滑、淡粉色的菌落(圖 1b)；在SS 瓊脂培養基中不生長。該菌革蘭氏染色不易脫色，鏡檢結果顯示為陰性短小球桿菌，多成雙排列，近似雙球菌，有時呈絲狀或鏈狀(圖1c)，將分離菌命名為DL01221。

圖1 分離菌形態a,普通營養瓊脂平板生長菌落; b,麥康凱平板生長菌落; c,分離菌革蘭氏染色觀察.

2.2 生化特性鑒定

對分離到的革蘭氏陰性菌進行生化鑒定，結果見表1。根據以上形態學觀察和生化鑒定結果，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[11]，初步鑒定該菌為鮑曼不動桿菌。

表1 分離菌株的生化鑒定結果

2.3 回歸感染試驗

經純培養的分離菌懸液腹腔注射烏龜后，試驗組在接種后第4 d出現精神萎靡，食欲減退等癥狀，注射7 d累計死亡率為42%。死亡的烏龜癥狀與自然病例相似。對照組在整個試驗期間未出現異常。從人工感染發病的龜體肝臟中，均分離到與自然發病分離菌相同的細菌。

2.4 16S rRNA序列分析

分離菌16S rRNA PCR擴增結果見圖2，產物經凝膠回收提純后測序。測序結果顯示，分離菌株16S rRNA基因序列長度為1416 bp。同源性分析結果顯示，分離菌與多數鮑曼不動桿菌菌株同源性超過99%，與斑點叉尾鮑曼不動桿菌株的同源性為98.7%；而與醋酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)、瓊氏不動桿菌(A.junii)、約翰遜不動桿菌(A.johnsonii)、溶血不動桿菌(A.haemolytius)及沃氏不動桿菌(A.lwoffii)同源性分別為97%、97.4%、96%、97%和95.7%。分離菌株DL01221的16S rRNA序列構建的系統進化樹見圖3，結果顯示本試驗分離菌株DL01221處于鮑曼不動桿菌群內，其中與法國和印度分離菌親緣關系最近，與中國斑點叉尾分離菌親緣關系較遠。

圖2 分離菌株DL01221的16S rRNA基因PCR擴增結果M. DNA標準DL2000；1. 分離

圖3 分離菌株DL01221的16S rRNA基因系統進化樹

2.5 藥敏試驗結果

用15種藥物敏感試紙對鮑曼不動桿菌DL01221進行藥敏試驗，結果發現，對頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢曲松、慶大霉素、妥布霉素、克林霉素、克拉霉素及四環素等7種藥物具有耐藥性；對頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星敏感；對阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、鏈霉素等中度敏感；抗菌藥紙片種類、含藥量、抑菌圈直徑及判斷結果見表2。

表2 藥敏試驗結果

注：CLSI藥敏試驗紙片法判定標準：S，敏感；I，中介；R，耐藥.

3 討 論

目前，隨著龜養殖業的快速發展，龜的養殖規模在不斷擴大，但水質惡化、養殖密度過高等原因導致龜鱉疾病發生也日益頻繁，嚴重影響了龜鱉養殖產業的可持續發展[4]。龜類疾病大多由細菌、真菌和病毒感染引起，而細菌感染引起的疾病是水生動物的常發傳染病[12-22]，在龜鱉養殖業中也屬于高發和頻發疾病[4]，特別是近年來，龜鱉的細菌性疾病呈現了爆發流行之勢。鮑曼不動桿菌是奈瑟氏球菌科不動桿菌屬中的一種革蘭陰性球桿菌，該菌對人和動物是一種常見的條件性致病菌，能通過多種方式感染人體使其患病，最常見的是引起人的肺炎、敗血癥、腦膜炎、骨髓炎等[23]。該菌感染動物可引起新生駒患敗血癥，牛患乳腺炎，鱺患敗血癥，水牛感染后會流產等[24]，目前有發現不動桿菌存在于患病的水生動物體內[7-8,25]。本研究自患病烏龜體內分離出致病菌，通過形態學和生化特性初步鑒定為鮑曼不動桿菌。該菌革蘭氏染色不易脫色，與其他研究報道的鮑曼不動桿菌脫色不易的結果相似，但是具體原因尚不明確，猜測可能與該菌的細胞壁有關[7-8,20]。本研究基于16S rRNA序列進行了不動桿菌屬的系統發育分析，發現本試驗分離菌DL01221落于鮑曼不動桿菌群，與其他鮑曼不動桿菌同源性超過98%，確定該菌株為鮑曼不動桿菌。通過動物回歸試驗證實，該分離株可感染龜，并導致其發病。

近年來，隨著廣譜抗生素在臨床上的廣泛使用，多重耐藥的鮑曼不動桿菌逐漸增多，嚴重威脅著人類健康[26]。鮑曼不動桿菌在臨床上的研究受到國內外的廣泛關注，但作為龜類的病原菌，尚未見報道。本研究從患病烏龜體內分離的鮑曼不動桿菌DL01221進行藥敏試驗，發現分離到的菌株耐藥性與陸文浩等[8]報道的魚源鮑曼不動桿菌菌株的耐藥性有一定差異，如本分離鮑曼不動桿菌DL01221對頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星等抗生素敏感；對阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、鏈霉素等抗生素中度敏感；對頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢曲松、慶大霉素、妥布霉素、克林霉素、克拉霉素及四環素等抗生素具有較強耐藥性，而魚源的鮑曼不動桿菌對妥布霉素、慶大霉素、左氟沙星和鏈霉素高度敏感，對四環素中度敏感，對頭孢他啶、頭孢噻肟等產生耐藥。這也符合不同報道中提到的國內不同地區分離的鮑曼不動桿菌的耐藥性有一定差異[8,27]。可能原因為菌株所處的環境和當地的用藥習慣不同而導致同種菌對同種抗生素表現出不同的耐藥性。

隨著龜類疾病的高發，養殖場為追求暫時的經濟效益，濫用化學藥物或盲目加大藥物的使用劑量，使許多致病菌產生抗藥性，治療困難。鮑曼不動桿菌不但影響人類健康，對龜鱉動物的潛在威脅也逐漸暴露出來，而且鮑曼不動桿菌對多種抗生素具有天然耐藥性，臨床上治療較為困難。因此，關注藥物殘留對水源的影響，不僅是實施龜鱉健康養殖的有效措施，而且對人類的健康具有促進意義。

[1] 章劍, 王保良. 龜鱉病害防治黃金手冊[M]. 2版.北京: 海洋出版社, 2012.

[2] 朱凌宇，戴愛敏，董明倩，等. 中華鱉養殖水體光合細菌的分離、鑒定與固定化[J]. 水產科學, 2014, 33(8):493-497.

[3] 林亞歌，葉鍵，石婷婷，等. 中華鱉源奇異變形桿菌的分離鑒定與致病性研究[J]. 水產科學, 2014, 33(12):800-803.

[4] 洪美玲, 付麗容, 王銳萍, 等. 龜鱉動物疾病的研究進展[J]. 動物學雜志, 2003, 38(6):115-119.

[5] 趙劍, 黎昆, 李科, 等. 639株鮑曼不動桿菌分布及耐藥性分析[J]. 中國執業藥師, 2015, 12(8):7-9.

[6] El-Ageery S M, Abo-Shadi M A, Alghaithy A A, et al. Epidemiological investigation of nosocomial infection with multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(13):1834-1839.

[7] 顧澤茂, 柳陽, 陳昌福, 等. 鮑曼不動桿菌斑點叉尾株的分離與鑒定[J]. 華中農業大學學報, 2010, 24(4):489-493.

[8] 陸文浩, 陳輝, 鄒勇, 等. 銀鯽不動桿菌病原菌鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學, 2010, 29(3):156-161.

[9] 李建強，李六金. 獸醫微生物學實驗實習指導[M]. 西安：陜西科學技術出版社，1999:32-40.

[10] 彭凌, 楊旭夫, 朱必鳳, 等. 豬鏈球菌廣東株的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 動物醫學進展, 2015, 36(2):130-133.

[11] 東秀珠,蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[12] 張曉君,畢可然,閻斌倫,等.矛尾復虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及特異性檢測方法的建立[J].水產科學,2011,30(12):758-763.

[13] 夏飛,梁利國,謝駿.團頭魴病原嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].水產科學,2012,31(10):606-610.

[14] 陶詩,何芳芳,劉雪珠,等.海水養殖魚類病原微生物研究進展[J].水產科學,2013,32(3):175-182.

[15] 隗黎麗，王自蕊，楊竹青. 草魚2株氣單胞菌的分離與鑒定[J]. 水產科學, 2013, 32(6):348-352.

[16] 李春濤,楊秀營,蔣自立.大鰭鳠腹部一種感染性疾病病原菌確定及藥敏研究[J].水產科學,2014,33(3):171-174.

[17] 楊寧，黃海，張希，等. 尼羅羅非魚嗜水氣單胞菌病的病原分離鑒定和藥敏試驗[J]. 水產科學, 2014, 33(5):306-310.

[18] 周毅，張培培，徐曄，等. 金魚嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學, 2014, 33(6):379-384.

[19] 沈曉靜，胡秀彩，蘭云，等. 錦鯉熒光假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學, 2014, 33(7):443-446.

[20] 張培，朱愛華，胡秀彩，等. 金魚類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產科學, 2015, 34(6):375-379.

[21] 李聰，蔡巖，周永燦，等. 海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水產科學, 2015, 34(10):640-646.

[22] 藍勝華,王利,鄧麟杰,等.黃顙魚溶酪巨型球菌的鑒定與藥敏試驗[J].水產科學，2015,34(12):748-752.

[23] Méndez J A, Mateos J, Beceiro A, et al. Quantitative proteomic analysis of host-pathogen interactions: a study ofAcinetobacterbaumanniiresponses to host airways[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1):422.

[24] 陸承平. 獸醫微生物學[M]. 4版.北京: 中國農業出版社, 2007.

[25] 顧天釗, 陸承平, 陳懷青. 鮑氏不動桿菌—鱖魚暴發性死亡的新病原[J]. 微生物學通報, 1997, 24(2):104-106.

[26] 黃一睿, 甘文思, 夏優秀, 等. 鮑氏不動桿菌的臨床分布與耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志, 2015, 25(8):1693-1695.

[27] 馬越, 李景云, 姚蕾,等. 不同地區鮑曼不動桿菌臨床分離株的耐藥性比較[J]. 中國抗感染化療雜志, 2003, 3(5):306-308.

Isolation,IdentificationandDrugSensitivityofAcinetobacterbaumanniifromTortoiseMauremysnigricans

DING Li1, LI Junyu1, DAI Xiaomei1, WANG Jichao1, FANG Zhenhua2, SHI Haitao1

( 1.College of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou 571158, China;2. School of Biological Engineering, Hainan College of Vocation and Techniques, Haikou 570216, China )

One predominant bacterial strain named DL01221 was isolated from the liver of diseased tortoiseMauremysnigricans, identified by morphologic observation, biochemical test, and sequencing analysis of 16S rRNA, and then the drug sensitivity was determind by Kirby-Bauer′s agar diffusion method. Results showed that the strain was gram negative bacterial. By analyzing the homology and phylogenetic relationship of 16S rRNA sequences in the NCBI database, the homology was found to be more than 98% compared toAcinetobacterbaumannii, which was in the same group withA.baumannii. Combining with the colonial morphology and biochemical results, the strain was identified asA.baumannii. Inoculating the strain toM.nigricansfor lethality indicated that the strain had pathogenicity and the same bacterium could be isolated from these animals. Meanwhile the drug sensitivity test showed the bacterium was sensitive to ceftazidime, kanamycin and fleroxacin, and multi-resistant to most antibiotics.

Mauremysnigricans;Acinetobacterbaumannii;isolation and identification; drug sensitive test

S947

A

1003-1111(2016)04-0426-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.020

2015-10-19；

2016-01-26.

國家自然科學基金資助項目(31502036、31372228)；海南省自然科學基金資助項目(314076、20153086)；海南省高等學校科學研究項目(Hnky2016—15).

丁利(1982—)，女，副教授，博士；研究方向：動物疾病. E-mail: dingli705@163.com. 通訊作者：史海濤(1963—)，男，教授，博士生導師；研究方向：龜鱉生態學. E-mail: haitao-shi@263.net.