滇橄欖對人口腔唾液流率、pH及細菌的影響研究

高 茜,謝 穎,黃海濤,倪紅梅,李雪梅,管 瑩,米其利,夭建華,*

(1.云南中煙工業有限責任公司,云南昆明 650106; 2.云南中醫學院,云南昆明 650500)

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滇橄欖對人口腔唾液流率、pH及細菌的影響研究

高 茜1,謝 穎2,黃海濤1,倪紅梅1,李雪梅1,管 瑩1,米其利1,夭建華1,*

(1.云南中煙工業有限責任公司,云南昆明 650106; 2.云南中醫學院,云南昆明 650500)

目的:研究滇橄欖對人體口腔唾液流率、pH及口腔細菌的影響。方法:分時段采集10名志愿者咀嚼滇橄欖前、咀嚼滇橄欖期間、咀嚼滇橄欖后的唾液,檢測志愿者唾液流率及pH的變化,同時采用熒光定量PCR實驗法檢測唾液中的總細菌及變形鏈球菌含量。結果:與咀嚼前相比,咀嚼滇橄欖后志愿者分泌唾液的量顯著增加,唾液的pH先降低后升高,口腔內細菌及變形鏈球菌的數目有所減少。結論:滇橄欖有促進人體口腔唾液分泌的作用,可以有效減少口腔內的細菌總數及變形鏈球菌數量,有一定預防齲齒的效果。

滇橄欖,唾液流率,熒光定量PCR實驗,齲齒

口腔是一個復雜的生態環境,唾液對于維持口腔內環境穩態起著至關重要的作用[1]。目前研究發現干燥綜合征(SS)、藥物、放射性治療、糖尿病、高血壓等都可導致涎腺分泌功能減弱,唾液流率明顯偏低[2-5]。唾液處在溫暖、黑暗的口腔里,構成了病菌、病毒和其他菌類的理想生存環境[6]。變形鏈球菌為革蘭氏染色陽性的球菌,是主要的致齲菌,可促進菌斑的形成,從而導致齲齒的形成[7-8]。

滇橄欖又名余甘果,系大戟科葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaLinn)的干燥成熟果實[9]。滇橄欖果實營養豐富,含有12種維生素、16種微量元素、16種氨基酸、有機酸、蛋白質、多酚、糖類等[10]。滇橄欖果實微寒微苦、甘、酸澀,具有健胃、消食、潤肺、生津、收斂止瀉、清熱降火、解毒、抗氧化[11]、消滯止咳、解除疲勞等作用[12],另一方面,滇橄欖中含有豐富的余甘子酸、黏酸等成分,具有較強的抗菌作用[13]。文獻表明用超臨界CO2萃取的余甘子精油對常見食品污染菌具有很好的抑制作用[14]。

表1 實時熒光定量PCR引物及探針

Table 1 The primers and probes of Real-time quantitative PCR

引物及探針序列5′-3′變形鏈球菌Forwardprimer5′GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT-3′Reverseprimer5′-GCCATACACCACTCATGAATTGA-3′探針FAM-TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA-TAMRA引物及探針序列5′-3′細菌通用Forwardprimer5′-CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG-3′Reverseprimer5′-TGTGACGGGCGGTGTGTA-3′探針FAM-CACGGTGAATACGTTCCCGGGC-TAMRA

滇橄欖被聯合國衛生組織制定為在全世界推廣種植的三種保健植物之一[12]。近年來,對滇橄欖功能因子的研究及其相應功能的食品的開發越來越受到重視,但對于滇橄欖對人口腔生津作用、pH改變及抗菌作用的研究仍較少。本實驗的主要目的是采用檢測志愿者唾液流率的變化來研究滇橄欖的生津功效,并檢測唾液的pH改變情況。同時采用了熒光定量PCR方法研究咀嚼滇橄欖對口腔內微生物的影響,以期為滇橄欖的開發使用提供一定的數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明市年齡為20～24歲的在校大學生健康人群,按照如下納入、排除標準篩選實驗對象。納入標準:無全身系統性疾病;牙齒完整,咬合關系正常;口腔衛生良好,牙周健康;無未經治療的齲齒;無口腔軟組織疾病,無長期服藥史;不使用含氟牙膏及漱口水;實驗前2周全身及口腔局部未使用抗生素。排除標準:進行正畸治療者;實驗中需要服用抗菌藥物者。按照以上納入、排除標準,最終篩選出10名受試者,其中男性8名,女性2名。

滇橄欖果實 云南昆明;變形鏈球菌引物及探針、細菌通用引物及探針 Invitrogen;(表1)、熒光定量PCR試劑盒 KAPATMProbe;微生物裂解液 Takara;熒光定量PCR96孔板、熒光定量PCR96孔板膜 Biotipsci;無水乙醇 西隴化工;標準菌株:變形鏈球菌ATCC25175。

LC480熒光定量PCR系統 瑞士Roche公司;3-18K高速冷凍離心機 美國Sigma公司;HH-S26s恒溫水浴鍋 上海博訊公司;臺式pH計，XS204分析天平 瑞士Mettler公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 唾液采集 采集唾液在安靜的房間里進行,受試者平坐于椅上,上身稍前傾,手持帶漏斗的量杯,將口內分泌的唾液外吐于量杯內,且受試者在實驗前2周和實驗期間未服用抗生素類藥物及影響唾液分泌的藥物,實驗前2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸煙。每位受試者分別給予(12±0.5) g滇橄欖果實一枚。采集唾液的方法為吐取法:使唾液在口底聚集,受試者每隔一定時間將其通過玻璃漏斗吐入15 mL離心管。采集唾液的總持續時間為22 min。具體時間段為:0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、20～22 min。受試者開始咀嚼橄欖的時間為2 min,在10 min時停止咀嚼,從第10 min到第20 min中的這10 min為洗脫時間,咀嚼時間共持續8 min。

1.2.2 唾液流率及pH的測定 將采集好唾液稱重并記錄,計算不同時間段的平均唾液流率,并用pH計測量不同時間點的唾液pH。唾液流率計算公式如下:

每個時間段內唾液流率(g/min)=該時段內的唾液分泌重量(g)/收集時間(min)

1.2.3 DNA提取 實驗方法參見文獻[15]:取各個志愿者的唾液0.5 mL置于無菌1.5 mL EP管中,將EP管中唾液進行4 ℃離心10 min(12000 r/min),去除上清液,再加入50 μL微生物PCR專用裂解緩沖液于EP管中,混合均勻,然后置于80 ℃水浴鍋中熱變性15 min,低速離心1 min(1000 r/min),最后取上清液與無菌水按1∶8比例稀釋后作為熒光定量PCR的模板。

1.2.4 熒光定量PCR實驗 熒光定量PCR實驗方法參見文獻[16]:反應體系共20 μL,其中2×mix 10 μL、上下游引物各200 nmol/L、探針250 nmol/L、無菌水1.475 μL、模板(上清液)8 μL且混合均勻。反應條件參見文獻[16]為:預變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 15 s,退火/延伸 60 ℃ 1 min,進行45個循環。分別將通用菌(通用菌采用牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的混合菌)和變形鏈球菌標準品DNA按10倍梯度稀釋作為模板進行定量PCR,制作標準曲線。每個樣本檢測均重復3次,取其平均值,每次反應均設空白對照。

2 結果與分析

2.1 唾液流率結果

志愿者在咀嚼滇橄欖之前(0～2 min)的平均靜態唾液流率為1.16 g/min。在咀嚼滇橄欖后2 min(2～4 min)中唾液流率達到峰值(3.10 g/min),是靜態唾液流率的2.7倍。隨著咀嚼時間的延長,唾液流率逐漸降低,但仍高于靜止狀態,20～22 min的唾液流率(1.53 g/min)是靜態唾液流率的1.32倍(圖1)。

表2 唾液中變形鏈球菌數量變化趨勢表

Table 2 Change trend of the number ofStreptococcusmutansin saliva

志愿者編號唾液中變形鏈球菌數量(不同時間段)0～2min2～4min4～6min6～8min8～10min20～22min1NNNNNN2035×102±001×102NNNNN3208×102±007×102NNNN046×102±006×1024036×102±002×102NNNNN5NNNNNN6040×102±000×102NNNN005×102±001×102714921×102±213×1023051×102±093×102NNN043×102±022×1028NNNNNN9051×102±000×102047×102±000×102NNN008×102±001×10210NNNNNN

圖1 唾液流率變化圖Fig.1 Change of saliva flow rate

注:N表示未檢出。2.2 pH檢測結果

志愿者在咀嚼滇橄欖之前的靜態唾液的pH平均值為7.07。咀嚼滇橄欖后唾液pH呈下降趨勢,在2～4 min降到最低值(4.17),隨著咀嚼時間的延長,唾液pH又呈上升趨勢,20～22 min時唾液pH達到所有時間段里的最高值(7.67),即停止咀嚼滇橄欖后的唾液pH為最大值,高于靜止狀態的pH(p<0.01)(圖2)。

圖2 唾液pH變化圖Fig.2 pH change of saliva

2.3 熒光定量PCR的檢測結果

變形鏈球菌標準品的標準曲線見圖3,受試者唾液中的變形鏈球菌的含量變化見表2:在咀嚼滇橄欖之前,10個受試者唾液中有6個檢測出變形鏈球菌,測出的唾液中變形鏈球菌平均含量為25.49×102個/mL,在咀嚼滇橄欖10 min后(20～22 min時段)有4個受試者唾液檢出變形鏈球菌,變形鏈球菌平均含量為0.26×102個/mL,低于咀嚼滇橄欖之前的含量。說明在咀嚼滇橄欖之后,變形鏈球菌含量有所減少,而在咀嚼滇橄欖期間,僅有2～4 min時段有2個受試者唾液檢出變形鏈球菌,其他時段均未檢出。

圖3 實時熒光定量PCR檢測變形鏈球菌構建的標準曲線Fig.3 Standard curve of Streptococcus mutans for real-time quantitative PCR

總細菌標準品的標準曲線見圖4,受試者唾液中的總細菌含量變化可由圖5看出:在咀嚼滇橄欖之前,總細菌的數目是所有時間段里的最大值,在開始咀嚼滇橄欖的2 min內,總細菌數目迅速降到最低值,隨著咀嚼時間的延長,細菌的數目有所波動,但在停止咀嚼滇橄欖10 min之后的細菌數目仍小于咀嚼滇橄欖之前。

圖4 實時熒光定量PCR檢測總細菌構建的標準曲線Fig.4 Standard curve of total bacterial for real-time quantitative PCR

圖5 唾液中細菌數量變化趨勢圖Fig.5 Change trend of the number of total bacterial in saliva

3 結論與討論

唾液有濕潤口腔、調和食物、保持味覺的作用。人的舌頭能在口腔中自由活動,全靠唾液的幫助,說話、進食都少不了它。所以也把唾液稱為“口腔潤滑劑”[17]。本實驗通過觀測受試者咀嚼滇橄欖前后唾液流率的變化,研究了滇橄欖對人體唾液分泌的影響。由圖1 的唾液流率變化趨勢圖可以看出:咀嚼滇橄欖可有效刺激涎腺分泌唾液,隨著咀嚼時間的延長,涎腺受到的有效刺激有所減少,故唾液流率呈緩慢下降的趨勢,但仍高于靜態唾液流率。唾液流率增加的原因有二,根據對志愿者唾液的pH檢測結果,在開始咀嚼滇橄欖時pH驟然下降,主要原因是滇橄欖本身的性味為酸,其中含豐富的余甘子酸和黏酸等成分,從而導致味覺刺激分泌更多的唾液,二是咀嚼本身帶來一定的機械刺激,也有促進唾液分泌的功效。總之,滇橄欖能有效刺激涎腺分泌唾液,有一定的生津潤燥、治療口干的作用。但由于本次實驗條件所限,僅采集了受試者咀嚼后10 min后的唾液,至于滇橄欖是否能在更長時間內增加唾液的分泌及持續抑菌效果上仍待進一步研究。

齲病是口腔常見病和多發病,是牙齒在多種因素共同作用下,發生硬組織脫礦、有機物溶解和牙組織進行性破壞導致缺損的一種疾病[18]。而變形鏈球菌是口腔中常見的革蘭氏陽性鏈球菌,也是口腔主要的致齲菌之一。熒光定量PCR的結果表明咀嚼滇橄欖過程中及咀嚼前后,口腔內的變形鏈球菌和細菌數目都有所減少。結合文獻分析主要有如下原因:一是文獻表明滇橄欖中含有大量抗菌物質可在體外對口腔中的微生物起到抑制作用:余甘子甲醇提取液對5個致病菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、普通變形桿菌、產氣腸桿菌)具有抗菌活性[9],另外有研究表明用超臨界CO2萃取的余甘子精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希式桿菌、沙門氏菌、啤酒酵母、米曲霉等常見食品污染菌具有很好的抑制作用[14];滇橄欖中含豐富的余甘子酸、黏酸、沒食子酸等成分,有一定的抗菌作用[19]。二是唾液流率的增加,對口腔起到一定的清潔作用,從而導致微生物數量的降低,有研究表明:人體口腔唾液中含有一類抗菌蛋白質為溶菌酶,具有抗菌消炎、增強機體免疫力等方面的藥理作用,溶酶菌可以阻止齲齒的發生,故滇橄欖刺激人體口腔分泌唾液,有一定的抗菌作用[20]。三是由于變形鏈球菌的致齲原因主要是通過發酵多種碳水化合物產生乳酸,降低菌斑的pH,從而導致牙齒脫礦,在停止咀嚼滇橄欖后唾液的pH高于咀嚼滇橄欖之前的pH,說明在咀嚼滇橄欖之后,使咀嚼滇橄欖使口腔內環境稍微偏堿性,從而起到一個長時間的抗齲作用[21]。這三個原因的共同作用,導致了本文實驗檢測出的總細菌及變形鏈球菌的數量在滇橄欖咀嚼中及咀嚼后均有所減少。

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Effect of theFructusphyllanthion the human saliva flow rate,pH and bacterial

GAO Qian1,XIE Ying2,HUANG Hai-tao1,NI Hong-mei1,LI Xue-mei1,GUAN Ying1,MI Qi-li1,YAO Jian-hua1，*

(1.China Tobacco Yunnan industrial Corporate Limited,Kunmin 650106,China； 2.Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China)

Objective:TostudytheeffectoftheFructus phyllanthionthehumansalivaflowrate,pHandbacterial.Methods:Thesalivabothbeforeandafterchewingform10volunteerswerecollected,thesalivaflowrateandpHchangeweredeterminedandthetotalbacteriaandStreptococcus mutanscontentinsalivaweredetectedusingreal-timePCRexperiment.Results:Comparedwiththeresultsbeforechewing,volunteerssalivaflowratewasincreasedsignificantlyafterchewingFructus phyllanthi,thepHwasdecreasedfirstandthenincreased,thenumberoftotalbacteriaandS. mutansweredecreased.Conclusion:Fructus phyllanthicouldpromotehumansalivasecretion,andeffectivelyreducethenumberoftotalbacteriaandS. mutansintheoral,therewasacertaineffectonthepreventionofdentalcaries.

Fructus phyllanthi;salivaflowrate;real-timePCR;dentalcaries

2016-04-27

高茜(1984-)，女，博士，助理研究員，研究方向：生物學，E-mail:gaoqian840905@163.com。

*通訊作者:夭建華(1968-)，女，博士，研究員，研究方向：煙草生物學,E-mail:jhyao_2007@126.com。

云南中煙工業有限責任公司項目(2015JC02)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)19-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.060