小柴胡湯逆轉人肝癌細胞BEL-7402/5-FU的多藥耐藥作用*

趙錦燕　劉麗雅　張毓宸　馮健愉　曾建偉　洪振豐#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院福州　350122；2福建省老年性疾病重點實驗室福州　350122）

小柴胡湯逆轉人肝癌細胞BEL-7402/5-FU的多藥耐藥作用*

趙錦燕1,2劉麗雅1,2張毓宸1,2馮健愉1,2曾建偉1,2洪振豐1,2#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院福州350122；2福建省老年性疾病重點實驗室福州350122）

目的：研究小柴胡湯對BEL-7402/5-FU細胞多藥耐藥的逆轉作用，并初步探討其作用機制。方法：采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測不同化療藥物以及小柴胡湯對BEL-7402/5-FU細胞的半數抑制濃度（IC50），計算耐藥指數和小柴胡湯的逆轉倍數；流式細胞儀檢測細胞內阿霉素的熒光強度；RT-PCR檢測mdr1基因表達；western blot檢測p-gp蛋白表達。結果：BEL-7402/5-FU耐藥株對5-FU和阿霉素順鉑均具有耐藥性，耐藥指數分別是6 501.99和31.73；0.5 mg/ml小柴胡湯和5-FU、阿霉素聯合應用，其逆轉倍數分別是1.66、1.50；1.0 mg/ml小柴胡湯和5-FU、阿霉素聯合應用，其逆轉倍數分別是3.44、5.58；小柴胡湯增強阿霉素的熒光強度；小柴胡湯降低mdr1基因表達和p-gp蛋白表達，各個濃度均具有統計學意義。結論：小柴胡湯可以抑制mdr1基因編碼蛋白產物p-gp的表達，增加細胞內化療藥物的濃度，從而逆轉了肝癌細胞的多藥耐藥性。

肝癌；小柴胡湯；多藥耐藥；逆轉

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是世界上常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居癌癥中的第6位，死亡率位居第3位[1]。在我國，因肝癌死亡的人數每年約11萬，幾乎占全世界肝癌死亡人數的45%[2]?；熓歉伟┲委煹囊粋€重要手段，盡管臨床上不斷推出新的抗癌藥物及化療方案，但療效卻不盡如人意。導致這一現象的主要原因是肝癌細胞對化療藥物產生了耐藥性，即多藥耐藥（Multidrug Resistance，MDR）。中醫藥作為我國國粹，因其具有“高效、低毒、多靶點”等特性，被廣泛應用于各種腫瘤的治療。大量的臨床資料表明，化療配合中藥治療腫瘤比單純化療或中藥治療具有更好的療效和更低的不良反應。從天然藥物中尋找具有高效低毒的逆轉劑成為提高化療療效的關鍵，也是目前研究的熱點之一[3～4]。大量研究表明，小柴胡湯及其加減方被廣泛用于防治多種惡性腫瘤[5～7]。本研究以人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU為研究對象，旨在探討小柴胡湯對肝癌細胞多藥耐藥的逆轉作用及其可能的作用機制。現報告如下：

1　材料與方法

1.1實驗材料細胞株：人肝癌細胞株BEL-7402及人肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU均購自南京凱基生物技術公司。藥物：柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、大棗、生姜購自福建省同春藥業股份有限公司。參考2010版《中國藥典》完成小柴胡湯藥物配制。柴胡、黃芩、人參、甘草及大棗加水煎煮2次，每次1.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量；半夏、生姜用100 ml 70%乙醇浸泡24 h，收集提取液，回收乙醇，與上述濃縮液合并，濃縮至相對密度為1.08～1.10（60℃）的藥液，噴霧干燥，制成干浸膏粉，備用。主要試劑：胎牛血清（批號：10099-141）、胰酶（批號：1391607）和RPMI-1640培養液（批號：C11875500CP）購自Life公司；MTT購自美國AMRESCO公司（貨號：0793）；Trizol（批號：9109）和逆轉錄試劑盒（批號：DRR037A）購自TaKaRa公司；阿霉素（ADM）購自美國sigma公司（批號：D1515）；p-gp抗體購自博奧森公司（批號：BS-0563R）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養人肝癌細胞株BEL-7402培養于RPMI1640培養液，內含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，置37℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養；人肝癌細胞BEL-7402/5-FU除上述培養條件外，還需在培養液中加入終濃度20 μg/ml 5-FU以維持細胞的耐藥性。

1.2.2兩株細胞對化療藥物的敏感性檢測取指數生長期的BEL-7402細胞和BEL-7402/5-FU細胞胰酶消化后，按1×105個/ml的密度接種于96孔板，培養24 h，分別用5-FU和ADM干預，每個濃度設8個復孔，并設空白對照組。繼續培養48 h后，棄上清，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl繼續培養4 h后，棄去上清，每孔加入100 μl DMSO，震蕩溶解沉淀，酶標儀在波長570 nm下讀取吸光度值，通過SPSS11.5軟件計算各種化療藥物對BEL-7402細胞和BEL-7402/5-FU細胞的50%抑制率的劑量（IC50），計算耐藥指數（RI）。RI=IC50（BEL-7402/5-FU）/IC50（BEL-7402）。

1.2.3小柴胡湯逆轉耐藥情況上述同樣方法接種細胞，培養24 h后，0.5 mg/ml和1.0 mg/ml小柴胡湯分別和不同的化療藥物聯合應用，干預48 h后，用MTT法測定各組OD值，計算IC50和逆轉倍數（Reversal Fold）［RF=IC50化療藥物/IC50（化療藥物+小柴胡湯）×100%］；相對逆轉率（Relative ReversalRate，RRR）=[（IC50化療藥in BEL-7402/5-FU－IC50化療藥+XCHTin BEL-7402/5-FU）/（IC50化療藥in BEL-7402/5-FUIC50化療藥inBEL-7402）]×100%。

1.2.4細胞內阿霉素的蓄積BEL-7402/5-FU細胞經接種和小柴胡湯干預48 h后，重新消化、離心、細胞計數后，調整細胞濃度至1×106/ml，取1 ml加入1 mg/ml的阿霉素5 μl，在37℃孵育10 min后離心（1 000 rpm，3 min），除去培養基，再用新鮮培養基洗去細胞外的染料；用1 ml新鮮RPIM1640培養基重懸，在37℃培養箱中孵育30 min；離心，棄上清，用預冷的PBS清洗3遍后，以流式細胞儀（FACS）用488 nm激發光檢測10 000個細胞內的熒光強度，計算熒光強度平均值。

1.2.5RT-PCR檢測mdr1 mRNA的表達按上述方法接種細胞，干預48 h后，Trizol法提取細胞中總RNA。以管家基因GAPDH為對照，引物序列利用Primer 5.0軟件進行設計，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果用Bio-Rad凝膠成像分析系統進行電泳條帶分析，引物序列及擴增產物片段長度：mdr1（228bp）F：5’-CAA GCA CTG AAA GAT AAG AAA GAA-3’；R：5’-GAA ACA TCC AGC ATA GGA AAA ATA-3’。

1.2.6western blot檢測p-gp蛋白的表達實驗分組及處理方法同前。各組收集細胞后，使用含有PMSF的Western和IP裂解液500 μl裂解細胞，10 000×g高速離心10 min，收集上清后BCA法進行蛋白定量。各組樣本取50 μg蛋白加入上樣緩沖液后100℃變性5 min。SDS-PAGE上樣電泳，條件：濃縮膠電壓80 V，分離膠100 V。電泳完后進行轉膜：100 V條件下45 min將蛋白轉移至PVDF膜上。常溫封閉120 min后一抗4℃孵育過夜。然后將PVDF膜用TBS-T（0.05%tween-20）漂洗3次×10 min，常溫二抗孵育1 h，再次用TBS-T漂洗3次× 10 min。使用BeyoECL Plus化學發光試劑處理PVDF膜，于化學發光成像系統ChemiDocXRS+下成像。

1.3統計學處理所有數據均采用SPSS11.5統計學軟件進行統計學處理，數據結果用均數±標準差（±s）表示，多組間樣本的均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為具有顯著性差異。

2　結果

2.1MTT法檢測藥物的敏感性MTT法檢測抗癌藥物對兩組細胞的細胞毒作用，對5-FU和ADM這2種化療藥物，BEL-7402組的IC50分別為：275.3和1.97 μM；BEL-7402/5-FU組細胞較親本細胞顯示出耐藥性，其IC50分別為：1.79×106和62.5 μM，其RI分別為：6501.99、31.73。通過結果分析可見BEL-7402/5-FU細胞除對5-FU有很高的耐藥性外，對ADM也出現交叉耐藥，即產生了多藥耐藥性。見表1。

表1　兩組細胞對不同化療藥物敏感性實驗結果

2.2小柴胡湯對BEL-7402/5-FU細胞耐藥性的逆轉效應0.5 mg/ml和1.0 mg/ml小柴胡湯與化療藥物（5-FU和ADM）聯合應用48 h后，其RF分別是1.66，1.50和3.44，5.58，相對逆轉率分別是39.88，34.11%和71.34，84.51%。

表2　小柴胡湯對BEL-7402/5-FU細胞的逆轉效果

2.3小柴胡湯對ADM在細胞內蓄積的影響肝癌耐藥細胞BEL-7402/5-FU經不同濃度小柴胡湯干預后，細胞內ADM熒光強度逐漸增強，呈劑量依賴。見圖1。

圖1　流式細胞儀檢測ADM在BEL-7402/5-FU細胞內的蓄積

2.4小柴胡湯對mdr1mRNA和p-gp蛋白表達的影響RT-PCR結果顯示，肝癌耐藥細胞BEL-7402/5-FU的mdr1表達較BEL-7402細胞明顯上調，小柴胡湯干預后，mdr1表達下調，呈劑量依賴；western blot結果顯示p-gp蛋白表達與mRNA表達趨勢一致。見圖2。

圖2　小柴胡湯對mdr1和p-gp表達的影響。A：RT-PCR檢測mdr1的mRNA表達；B：western blot檢測p-gp蛋白表達。

3　討論

化療是中晚期肝癌治療的重要手段，但肝癌化療的多藥耐藥現象，嚴重阻礙了化療藥物的作用[8]，影響患者的生存期。肝癌化療最重要的耐藥原因是mdr基因產物p-gp的過度表達[9]。p-gp是ATP依賴的跨膜糖蛋白，可將阿霉素等多種藥物排至細胞外，降低細胞內藥物的積聚，產生耐藥性[10]。尋找高效低毒的MDR逆轉劑是國內外學者研究的熱點[11]，在這方面中草藥有著很大的優勢，小柴胡湯作為治療少陽病的經典方，廣泛用于各種肝臟疾病的治療。前期研究發現小柴胡湯對肝癌有療效，但是具體作用的分子機制，尤其有無逆轉多藥耐藥的作用，尚有待進一步的研究。

小柴胡湯是由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、大棗、生姜7味藥組成，是治療少陽病證的主方，被譽為“少陽機樞之劑，和解表里之總方”，功能疏肝利膽、健脾和胃、降上逆之相火，契合肝癌病機。中醫藥傳統將小柴胡湯用于具有少陽病證候的發熱、惡心嘔吐、頭暈目眩、黃疸、瘧疾等。現代臨床研究發現小柴胡湯對于防治食管癌、肺癌、大腸癌、乳腺癌和肝癌均有顯著療效[5,12～15]。

本研究應用構建成功的肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU和親本BEL-7402細胞觀察小柴胡湯的逆轉作用。實驗結果發現，與BEL-7402細胞相比，耐藥株BEL-7402/5-FU具有更高的耐藥指數，小柴胡湯聯合化療藥物應用后有部分逆轉作用。進一步研究結果表明，小柴胡湯能夠增加化療藥阿霉素在BEL-7402/5-FU細胞內的蓄積，降低mdr1基因和p-gp蛋白的表達，提示小柴胡湯具有逆轉肝癌多藥耐藥的作用，可能是通過降低多藥耐藥蛋白p-gp的表達而實現的。至于其具體的逆轉能力及作用機制，我們將做進一步的探討。

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Xiaochaihu Tang Reverses Multidrug Resistance in Resistant Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line BEL-7402/5-FU

ZHAO Jin-yan1,2,LIU Li-ya1,2,ZHANG Yu-chen1,2,FENG Jian-yu1,2,ZENG Jian-wei1,2,HONG Zhen-feng1,2#
(1Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics,Fuzhou350122)

Objective:To determine the reversal effect of Xiaochaihu tang(XCHT)on the resistant human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU and explore its mechanism.Methods:The IC50of BEL-7402/5-FU cells was examined by MTT and calculated the resistance index(RI)and the reversal folds(RF)of XCHT.Intracellular Adriamycin(ADM)concentration was determined by flow cytometry.RT-PCR and western blot was used to detected the expression of mdr1 and p-gp respectively.Results:BEL-7402/5-FU showed resistance to variety of chemotherapeutic drugs,the RI of 5-FU or ADM was 6 501.99 or 31.73.XCHT(0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml)combined with 5-FU and ADM,the reversal fold was 1.66 and 1.50 or 3.44 and 5.58.XCHT increased the intracellular concentration of ADM. XCHT down-regulated the mdr1 and p-pg expression,and both had significant difference.Conclusion:XCHT can inhibit the expression of p-gp coded by mdr1 gene,and increase the intracellular concentration of chemotherapeutic drugs,so as to reverse the multidrug resistance of HCC cells.

Hepatocellular carcinoma;Xiaochaihu tang;Multi-drug resistance;Reverses

R96

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.001

國家自然科學基金項目（編號：81303125）

洪振豐，E-mail：zfhong1953@163.com

（2016-08-14）