冬蟲夏草水提取過程中腺苷轉化途徑研究

錢正明 甄達明 李文慶 李文佳 孫敏甜 楊豐慶 向 麗

(1 廣東東陽光藥業有限公司，東莞，523850； 2 重慶大學化學化工學院，重慶，400030； 3 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

?

冬蟲夏草水提取過程中腺苷轉化途徑研究

錢正明1甄達明1李文慶1李文佳1孫敏甜1楊豐慶2向 麗3

(1 廣東東陽光藥業有限公司，東莞，523850； 2 重慶大學化學化工學院，重慶，400030； 3 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

目的：通過比較分析不同條件下冬蟲夏草中7個核苷類成分的含量變化，探究冬蟲夏草藥材在水提過程中腺苷的轉化途徑。方法：首先建立冬蟲夏草中7個核苷類成分(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷、腺苷、肌苷、次黃嘌呤和腺嘌呤)的高效液相定量分析方法，并用所建立的分析方法比較不同提取方法和水提取添加對照品前后各相關成分的含量。結果：發現不同提取方法對冬蟲夏草腺苷含量具有顯著影響，冬蟲夏草在室溫水提取條件下腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷)可以轉化為腺苷，腺苷可以轉化為肌苷。結論：研究結果說明了冬蟲夏草在水提過程中的腺苷轉化途徑，為冬蟲夏草腺苷類成分的質量控制提升提供數據支持。

冬蟲夏草；腺苷；轉化途徑；高效液相

冬蟲夏草為傳統名貴中藥材，分布在我國青藏高原高海拔地區，其主產區包括西藏自治區、青海省和四川省，同時云南省和甘肅省也有小部分高原地區出產冬蟲夏草[1]。早在公元8世紀《月王藥診》記載其能“治肺部疾病”[2]，現代研究表明冬蟲夏草具有抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗衰老等活性[3-4]，核苷、多糖、甾醇、蛋白、多肽等物質為其活性成分，其中核苷類成分是冬蟲夏草的重要活性物質之一，具有提高免疫、調節心律失常、促進血液循環等多種功效[5-8]，并被廣泛運用于冬蟲夏草的質量控制研究，自2000年版《中華人民共和國藥典》起就采用腺苷作為其藥材含量測定的指標[9-12]。

前期很多學者對冬蟲夏草核苷類成分分析研究進行了報道，采用了各種現代化分析手段，包括：薄層色譜法、高效液相色譜法和高效毛細管電泳法[13-15]。通過比較前期發表結果，發現不同提取方法所測得的冬蟲夏草腺苷含量差異較大，含量高的達0.05%，含量低的只有0.01%[16-17]。楊豐慶等通過離子對色譜法對不同提取方法冬蟲夏草的核苷類成分進行了比較分析，從分析結果推測出冬蟲夏草核苷酸、核苷之間存在著轉化的現象[18]。但對于冬蟲夏草樣本中腺苷的轉化路線尚未全面展開，需進一步實驗的驗證。本研究在前期實驗結果的基礎上，建立了和腺苷相關的7種核苷類成分的定量方法，并通過比較對照品添加前后各成分的變化，闡明冬蟲夏草在提取過程中腺苷轉化的途徑，為其質量控制提供科學依據。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；XS204型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；XS205型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；3K15型離心機(西格瑪奧德里奇有限公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

1.2 材料 三磷酸腺苷和二磷酸腺苷對照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；單磷酸腺苷對照品(東京化成工業株式會社)；腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院)；肌苷、腺嘌呤、次黃嘌呤對照品(上海融禾醫藥科技有限公司)；對照品化合物結構式見(圖1)。甲醇為色譜純；水為超純水；其他化學試劑均為國產分析純。冬蟲夏草由東陽光藥業研究院提供，經錢正明鑒定為冬蟲夏草。

圖1 核苷類化合物結構式

2 方法

2.1 對照品溶液配制 分別精密稱取三磷酸腺苷26.15 mg、二磷酸腺苷27.06 mg、單磷酸腺苷25.99 mg、腺苷25.20 mg、肌苷26.48 mg、次黃嘌呤25.07 mg和腺嘌呤25.15 mg，于250 mL容量瓶中，加入超純水使其溶解并定容至刻度線，搖勻，即得單一對照品溶液。移取各單一對照品溶液適量于20 mL容量瓶中，加入超純水定容至刻度線，搖勻，過0.45 μm水系濾膜，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 甲醇(90%)回流提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL梨形瓶中，加入90%甲醇20 mL，密塞，搖勻，稱定重量，85 ℃下回流提取30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取1 mL上清液，吹干，加超純水1 mL復溶，過0.45 μm水系濾膜。

2.2.2 沸水超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入沸水20 mL，密塞，搖勻，室溫超聲30 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.2.3 室溫超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入超純水20 mL，密塞，搖勻。室溫超聲30 min。加入磷酸100 μL，震搖3 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.2.4 添加核苷室溫超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入超純水19 mL，再添加1 mL核苷單一對照品溶液，密塞，搖勻，室溫超聲30 min。加入磷酸100 μL，震搖3 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.3 色譜條件 Welch AQ-18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；流動相A為0.05 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4溶液(pH5.8)，流動相B為0.05 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4∶甲醇=9∶1溶液(pH 5.8)，梯度洗脫：0～14 min，0%B；14～25 min，0%～25%B；25～35 min，25%～90%B；35～40 min，90%～100%B；40～55 min，100%B；檢測波長260 nm；柱溫25 ℃；流速0.6 mL·min-1；進樣體積5 μL。

2.4 方法學驗證 精密度實驗：取混合對照品溶液，連續進樣5次，按“2.3”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算RSD。重復性實驗：精密稱取同一冬蟲夏草樣品6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，按“2.3”項下色譜條件進行分析，計算各成分含量的RSD值。穩定性試驗：精密吸取同一樣品供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，計算峰面積RSD值。準確度實驗：在空白溶液中加入混合對照品，按“2.3”項下色譜條件進行分析，測定各成分峰面積，計算平均回收率及RSD值。核苷標準曲線和定量限：取含7種核苷混合對照品溶液的系列稀釋液，按“2.3”項下色譜條件各進樣，記錄峰面積，以峰面積數值(Y)對濃度(X，μg·mL-1)進行線性回歸，得到三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、次黃嘌呤、單磷酸腺苷、腺嘌呤、肌苷和腺苷的標準曲線，同時以信噪比約為10的對照品溶液濃度為定量限。

3 結果與討論

3.1 分析條件優化 本研究組前期已成功建立了多個冬蟲夏草核苷類成分分析方法[19-21]，但前期發表的分析方法對本次實驗中的核苷酸類化合物分離效果較差。因此在前期實驗結果的基礎上對分析方法又進行了優化。首先在前期文獻方法上比較了不同流動相對化合物分離的影響，包括乙腈-水溶液系統、乙腈-乙酸銨溶液系統和甲醇-磷酸鹽溶液系統系統，結果顯示乙腈-水溶液系統無法將7種物質分開，乙腈-乙酸銨溶液系統對ATP化合物的保留能力太弱，而甲醇-磷酸鹽溶液系統對ATP保留能力強且7種化合物能達到基線分離，因此選擇了乙腈-磷酸鹽溶液系統作為流動相系統。然后比較了不同色譜柱的分離情況，包括：HILIC色譜柱、不同廠家的AQ色譜柱對7種化合物分離，結果顯示月旭AQ色譜柱對所分析的核苷類化合物具有較好的分離度，因此選擇月旭AQ色譜柱作為分離色譜柱。此外，對色譜分離的柱溫也進行了比較，結果發現25 ℃和30 ℃對化合物色譜分離影響不大，因此采用25 ℃作為分析柱柱溫。檢測波長綜合考慮前期文獻報道核苷類化合物檢測波長，選擇了260 nm作為檢測波長[14,18,21]。

3.2 方法學驗證 按“2.4”項下方法進行方法學驗證，結果見表1和表2，標準曲線相關系數均符合要求，結果如表1所示，各成分的精密度RSD<2%，重復性RSD<10%，回收率98%～102%(RSD<2%)，12 h內穩定性RSD<10%。方法學驗證結果說明該法穩定可靠，可用于冬蟲夏草中腺苷及其相關成分的含量測定。

表1 標準曲線

表2 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率

3.3 樣品分析 精密稱取冬蟲夏草樣品，按“2.2”項下方法，分別采用沸水超聲提取、90%甲醇回流提取和室溫超聲水提取的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行分析，獲得冬蟲夏草不同提取方法樣品色譜圖(圖2)，并采用外標法對相關成分進行測定，結果見表2。

圖2 冬蟲夏草色譜圖

通過比較冬蟲夏草不同提取制備樣本中的腺苷含量，發現室溫超聲水提取樣本腺苷含量(0.07%)顯著高于沸水超聲提取樣本(0.03%)和90%甲醇回流提取樣本(0.03%)，由此可以推測在室溫超聲提取過程中可能有其他成分向腺苷的轉化，而在沸水或90%甲醇的條件下該轉化途徑被抑制。進一步比較室溫超聲提取樣本和沸水超聲提取樣本中其他成分的含量，發現肌苷含量在室溫超聲提取樣本中(0.06%)比沸水超聲提取樣本中(0.02%)高，而二磷酸腺苷和單磷酸腺苷僅在沸水超聲提取樣品含有，因此可以推測在室溫超聲提取條件下二磷酸腺苷和單磷酸腺苷可能轉化為了腺苷和肌苷。

為了進一步驗證以上推測，本實驗選室溫水超聲為提取條件，采用添加對照品的方法逐個驗證化合物間的轉化現象。詳細實驗結果見表3，通過比較添加三磷酸腺苷冬蟲夏草室溫超聲提取樣本和未添加三磷酸腺苷樣本中各化合物的含量，發現添加的三磷酸腺苷未被檢測到，而腺苷和肌苷的含量有顯著的增加，該現象證實了在室溫超聲水提取的條件下存在三磷酸腺苷轉化為腺苷和肌苷的途徑。通過添加二磷酸腺苷和單磷酸腺苷對照品的實驗，也發現了同樣的情況，樣本中添加的二磷酸腺苷和單磷酸腺苷均未被檢測到，而腺苷和肌苷的含量有顯著增加，說明在實驗條件下存在著二磷酸腺苷和單磷酸腺苷轉化為腺苷和肌苷的途徑。通過添加腺苷提取實驗，發現樣本中腺苷含量和肌苷含量均有明顯增加，說明腺苷在實驗條件下可以部分轉化為肌苷。本實驗所得結果(圖3)驗證了前期文獻報道推測冬蟲夏草室溫水提取條件下，存在著單磷酸腺苷轉化為腺苷，腺苷轉化為肌苷的結論[18]。同時本實驗也發現了在室溫水提條件下還存在三磷酸腺苷和二磷酸腺苷向腺苷的轉化。

圖3 冬蟲夏草室溫水提取過程中腺苷類成分轉化路徑圖

表3 核苷添加試驗冬蟲夏草樣本中各分析物的含量

4 小結

我們建立了一種同時測定冬蟲夏草中7種核苷類成分的分析方法，并采用所建立的分析方法對添加核苷對照品前后的冬蟲夏草樣本溶液中核苷含量進行比較分析，結果顯示在室溫水超聲提取條件下冬蟲夏草水溶液中存在著腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷)向腺苷的轉化，腺苷向肌苷的轉化，該結果將為冬蟲夏草腺苷類成分的質量控制提升提供數據支持。

[1]董彩虹，李文佳，李增智，等.我國蟲草產業發展現狀、問題及展望——蟲草產業發展金湖宣言[J].菌物學報，2016，35(1)：1-16.

[2]黃長勝.冬蟲夏草[M].天津：天津科學技術出版社，2009：2.

[3]王林萍，余意，馮成強.冬蟲夏草活性成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21(7):132-136.

[4]T.B.Ng，H.X.Wang.Pharmacological actions of Cordyceps，a prized folk medicine[J].Pharmacy and Pharmacology，2005，57:1509-1519.

[5]Yu L，Zhao J，Li SP，et al.Quality evaluation of Cordyceps through simultaneous determination of eleven nucleosides and bases by RP-HPLC[J].Journal of Separation Science，2006，29(7)：953-958.

[6]Li SP，Li P，Ji H，et al.The nucleosides contents and their variation in natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps Mycelia[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2001，10(4)：175-179.

[7]Zhou XW，Gong ZH，Su Y，et al.Cordyceps fungi：natural products，pharmacological functions and developmental products[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61(3)：279-291.

[8]Pelleg A，Pennock RS，Kutalek SP.Proarrhythmic effects of adenosine：one decade of clinical data[J].American Journal of Therapeutics，2002，9(2)：141-147.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2000:86.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2005:75.

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010:106.

[12]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015:115.

[13]Ma KW，Chau FT，Wu JY.Analysis of the nucleoside content of Cordyceps sinensis using the stepwise gradient elution technique of thin-layer chromatography[J].Chinese Journal of Chemistry，2004，22(1)：85-91.

[14]梁洪卉，程舟，楊曉伶，等.HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分[J].中藥材，2008，31(1)：58-60.

[15]Yang FQ，Li S，Li P，et al.Optimization of CEC for simultaneous determination of eleven nucleosides and nucleobases in Cordyceps using central composite design[J].Electrophoresis，2007，28(11)：1681-1688.

[16]Feng K，Wang S，Hua DJ，et al.Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis and the nucleosides assessment of fungal strains isolated from natural Cordyceps sinensis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，50：522-526.

[17]陳玉婷，朱曼萍，王丹紅，等.HPLC測定冬蟲夏草不同藥用部位腺苷的含量[J].中國中藥雜志,2007，32(9):857-858.

[18]Yang FQ，Li DQ，Feng K，et al.Determination of nucleotides，nucleosides and their transformation products in Cordyceps by ion-pairing reversed-phase liquid chromatography-mass[J].Journal of Chromatography A，2010，1217：5501-5510.

[19]錢正明，孫培培，李文慶，等.冬蟲夏草高效液相特征圖譜分析[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2014，16(2)：279-283.

[20]Li WQ，Li WJ，Qian ZM，et al.Rapid analysis of polar components in Ophiocordyceps sinensis by conventional liquid Chromatography System[J].Chinese Herbal Medicines，2014，6(3)：217-221.

[21]錢正明，孫敏甜，艾中，等.一測多評法測定冬蟲夏草中3種核苷的含量[J].中國藥學雜志，2015，15(50)：1297-1300.

(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Adenosine transformation pathway during water extraction of Chinese Cordyceps

Qian Zhengming1，Zhen Daming1，Li Wenqing1，Li Wenjia1，Sun Mintian1，Yang Fengqing2，Xiang Li3

(1SunShineLakePharmCo.，Ltd，Donguan523850，China; 2SchoolofChemistryChemicalEngineering，Chongqing400030，China； 3InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective:To clarify the transformation pathway of adenosine during water extraction of Chinese Cordyceps.A HPLC method for simultaneous determination of seven nucleosides(adenosine triphosphate，adenosine diphosphate，adenosine monophosphate，adenosine，inosine，hypoxanthine and adenine)in Chinese Cordyceps was developed.By comparing the change of nucleosides’ contents before and after adding of standards，it was found that adenylate(adenosine triphosphate / adenosine diphosphate / adenosine monophosphate)can be transformed into adenosine，and adenosine can be transformed into inosine at room temperature water extraction condition.

Chinese Cordyceps; Adenosine; Transformation pathway; HPLC

國家中醫藥管理局中醫藥科學技術研究專項——中藥飲片質量保障體系研究(一)(編號：201507002)，負責人：李文佳

李文佳，主要研究方向：中藥資源與開發，E-mail：LiWenjia@hecpharm.com

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.002