三七酚類成分特征圖譜質量表征關聯評價研究

楊 元 陳 唯 張 芳 孔 靜 孫道涵 馮 朵 楊書娟 申立峰 胡少偉 周德勇 潘 婷 姜艷艷,3 石任兵,3

(1 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029; 2 首都醫科大學,北京,100000； 3 北京市教委中藥質量控制技術工程中心,北京,100029)

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中藥研究

三七酚類成分特征圖譜質量表征關聯評價研究

楊 元1陳 唯1張 芳1孔 靜1孫道涵1馮 朵1楊書娟1申立峰2胡少偉1周德勇1潘 婷1姜艷艷1,3石任兵1,3

(1 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029; 2 首都醫科大學,北京,100000； 3 北京市教委中藥質量控制技術工程中心,北京,100029)

采用HPLC-PDA法建立三七酚類成分特征圖譜,篩選9個特征峰并通過相對保留時間表征其質量關聯性,同時測定對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量,以對羥基苯甲酸為對照表征酚酸類含量,采用分光光度法測定三七中總酚含量,從而對三七酚類成分含量及其相對比值進行質量表征,然后對三七中各酚類成分含量進行關聯分析,從而發現各成分含量的關聯性、質量分布規律性,同時將不同批次的藥材與經過藥效驗證的參比藥材進行關聯度分析,結合關聯度分析,篩選出質量優佳三七藥材;運用本方法可全面精確的控制和評價三七的質量。

三七;特征圖譜;槲皮素;山柰酚;異鼠李素;總酚;關聯分析

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖。具有散瘀止血,消腫定痛的功效;用于咯血,吐血,衄血,便血,崩漏,外傷出血,胸腹刺痛,跌撲腫痛。在2015版《中國藥典》中以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量對三七進行質量控制[1];文獻對三七的質量表征研究貢獻在皂苷類[2-3]、氨基酸類[4-12]、總黃酮[13-16]的含量測定方面,而對酚類指標性成分、總酚含量測定方面尚未見報道。

然中藥的質量表征和質量評價應為其相關藥物體系所導向[21]。銀荷三七參方為王永炎院士擬定的臨床經驗方,由銀杏葉、三七、人參、荷葉組成,三七為其組方主要藥味。筆者在研究本方藥物制備物藥學-藥效質量表征關聯分析時發現,組方中酚類成分的含量及其相對比值的變化,對其活血止血功效有顯著性影響。可見,要實現三七藥物質量精準預期,需關聯其藥物體系進行質量表征。

因此,本文建立了三七酚類成分特征圖譜及對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、總酚的含量測定方法,從而對三七酚類成分含量進行測定與質量表征,然后對三七中各酚類成分含量進行關聯分析,從而發現各成分含量的關聯性、質量分布規律性,同時運用課題組所建立的中藥藥物質量表征關聯評價模式[17-20],進行有效指標性成分-類型-比值質量表征關聯分析評價,篩選出質量優佳三七藥材,以實現三七藥物質量精準控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 2695自動進樣高效液相色譜儀,2996PDA檢測器,Empower工作站;TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);Sartorius-BT25S型1/100000電子分析天平、KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。對羥基苯甲酸(批號:yy91251,純度≥98%)、槲皮素(批號:YY90129,純度≥98%)、山柰酚(批號:YY90129,純度≥98%)、異鼠李素(批號:YY90190,純度≥98%),均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈(色譜級,Fisher Scientific公司);甲醇(AR),購自北京化學試劑公司;娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);三氯化鐵(AR),購自天津市申泰化學試劑有限公司;鐵氰化鉀(AR),購自廣東汕頭市西隴化工廠;濃鹽酸(AR),購自北京化工廠;其余試劑均為分析純。15批三七藥材購自北京市各藥店,經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定均為Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根與根莖。藥材樣品現存于北京中醫藥大學中藥學院中藥化學系。

1.2 方法

1.2.1 特征圖譜方法學考察及指標性成分含量測定

1.2.1.1 對照品溶液的制備 取對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每毫升各含對羥基苯甲酸10 μg、槲皮素71.8 μg、山柰酚40 μg、異鼠李素29.2 μg的混合溶液,即得。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約10 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇300 mL,密塞,稱定重量,放置過夜,置80 ℃水浴保持微沸3 h,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液250 mL,回收溶劑至干,殘渣加30 mL水溶解,轉移至50 mL量瓶中,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz)30 min,取出,放冷,加水至刻度,搖勻,靜置,精密量取上清液40 mL,加入聚酰胺柱(100～200目,5 g,內徑1.5 cm,用水濕法裝柱)上,用20 mL水洗除雜,然后用50 mL5%氨水-甲醇洗脫,收集洗脫液,回收溶劑至干,殘渣加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液5 mL,加熱回流30 min,放冷,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇置刻度,搖勻,即得供試品溶液。

1.2.1.3 色譜條件 waters Atlantis色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)梯度洗脫(洗脫梯度0～12 min,12%A;12～60 min,12%～55% A),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長260 nm,進樣量20 μL。在此色譜條件下,對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素與其他色譜峰分離度良好,對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖見圖1。

圖1 酚類成分HPLC圖

1.2.1.4 特征圖譜方法學考察 1)特征圖譜精密度考察:按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件,連續進樣測定6次,計算各色譜峰與參比峰(峰5)的相對保留時間及相對峰面積,結果各特征峰相對保留時間RSD均小于0.83%,相對峰面積RSD均小于2.27%,表明精密度良好。2)特征圖譜穩定性考察:按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件,分別與0、2、4、6、12、24 h分別進樣,計算各色譜峰與參比峰(峰5)的相對保留時間及相對峰面積,結果各特征峰相對保留時間RSD均小于0.72%,相對峰面積RSD均小于2.88%,表明樣品溶液24 h內穩定。3)特征圖譜重復性考察:按照1.2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件進樣測定,計算各色譜峰與參比峰(峰5)的相對保留時間及相對峰面積,結果各特征峰相對保留時間RSD均小于0.87%,相對峰面積RSD均小于3.78%,表明樣品溶液重復性良好。

1.2.1.5 指標性成分含量測定方法 1)線性關系考察:分別精密量取1.2.1.1項下的混合對照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL,置5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得不同濃度的混合對照品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件,分別進樣測定對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積,以對照品的濃度(mg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程及相關系數為:對羥基苯甲酸:y=4×107x+4171.7,(r=0.999 7,n=6)、槲皮素:y=7×107x+52 081,(r=0.999 2,n=6);山柰酚:y=6×107x-3895 5,(r=0.999 4,n=6);異鼠李素:y=6×107x-37323,(r=0.999 5,n=6)。表明對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素分別在0.002～0.01 mg/mL、0.014 3～0.071 7 mg/mL、0.008 0～0.0399 9 mg/mL、0.005 8～0.029 2 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。2)精密度考察：按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件,連續進樣測定6次,測定對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積,計算RSD分別為為1.35%、0.83%、1.09%、1.27%,表明精密度良好。3)穩定性試驗：按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,分別于制備后0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h按照1.2.1.3項下方法測定峰面積,測得對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積RSD分別為1.45%、1.68%、0.74%、1.59%,表明供試品溶液在24 h內穩定。4)重復性試驗：按照1.2.1.2項下方法平行制備供試品溶液6份,按照1.2.1.3項下方法測定峰面積,測得對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素平均含量分別為0.0004%、0.0072%、0.0025%、0.0020%,RSD分別為2.53%、1.50%、2.25%、1.51%,表明此方法重復性良好。5)加樣回收率考察：精密稱取三七粉末約5 g,共6份,加入對照品適量,按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照1.2.1.3項下方法測定峰面積,計算對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素平均加樣回收率分別為98.25%、97.93%、98.41%、98.67%,RSD分別為為2.54%、2.60%、0.91%、2.08%,表明本方法準確可靠。

1.2.2 總酚含量測定方法

1.2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約0.8 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入100 mL 70%甲醇,密塞,稱定重量,放置過夜,超聲(功率500 W,頻率40 kHz)處理1 h,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得供試品溶液。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加70%甲醇制成含33 μg/mL的溶液,即得。

1.2.2.3 吸光度的測定方法 精密量取供試品溶液適量,置于25 mL棕色量瓶中,加50%甲醇至5 mL,加入0.3%十二烷基硫酸鈉溶液2.6 mL,搖勻,加入新配置的0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1:1)混合液2.0 mL,在暗處放置7 min,用0.1%的鹽酸定容至25 mL,搖勻后于暗處靜置40 min,以相應的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法(中國藥典通則0401)在780 nm的波長處測定吸光度。

1.2.2.4 線性關系考察 精密量取槲皮素對照品溶液0.1 mL，0.3 mL，0.5 mL,0.7 mL,0.9 mL,按照1.2.2.3項下的方法進行測定,以對照品量(mg)為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,并進行線性回歸分析,計算回歸方程為y=31.554x-0.033 0(r=0.999 5,n=5)。結果表明,槲皮素對照品量在0.003 3～0.029 7 mg范圍內與吸光度線性關系良好。

1.2.2.5 重復性試驗 按照1.2.2.1項下方法平行制備供試品溶液6份,按照1.2.2.3項下的方法測定吸光度,計算總酚平均含量為1.99%,RSD為0.86%,表明此方法重復性良好。

1.2.2.6 加樣回收率考察 精密稱取同一三七粉末約0.4 g,共6份,置于具塞錐形瓶中,分別加入對照品適量,然后精密加入100 mL 70%甲醇,密塞,稱定重量,放置過夜,超聲(功率500 W,頻率40 kHz)處理1 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得總酚加樣回收率供試品溶液;按照1.2.2.3項下的方法測定吸光度,計算總酚平均加樣回收率103%,RSD為1.82%,表明本方法準確可靠。

表1 三七酚類成分質的關聯性

表2 基于酚類成分含量的15批三七藥材樣品質量表征(%，n=2)

表3 基于酚類含量相對比值的15批三七藥材樣品質量表征

表4 15個批次三七藥材樣品關聯度表征

2 結果

2.1 基于三七酚類成分質的表征 取15批三七藥材,按照1.2.1.1項下方法制備對照品溶液,按照1.2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照1.2.1.3項下色譜條件,分別進樣,得到15批三七藥材特征圖譜(圖1),特征圖譜在260 nm下含特征峰9個,其中黃酮類特征峰3個,酚酸類特征峰6個,15批三七藥材均含此9個特征峰。選擇槲皮素為S峰,將其保留時間設為1,其他特征性成分的保留時間做相應轉換,計算各特征峰的相對保留時間。結果見表1。

2.2 基于三七酚類成分量的表征

2.2.1 基于酚類成分含量的質量表征 取15批三七藥材樣品,按“1.2.1”項下方法測定對羥基苯甲酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量，以槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量加和表征黃酮類含量和;以對羥基苯甲酸為對照品,通過主要酚酸類成分峰面積加和表征酚酸類含量和;按“1.2.2”項下方法測定總酚含量;以經過藥效驗證的藥材(樣品號14)作為參比藥材;從而對三七藥材中有效指標性成分與總成分的含量進行全面表征。結果見表2。

2.2.2 基于酚類成分含量相對比值的質量表征 以有效指標性成分槲皮素的含量為參比,將15個三七藥材樣品中各成分含量與槲皮素含量的相對比值予以表征,結果見表3。

2.2.3 三七質量表征關聯分析

2.2.3.1 三七藥材酚類成分含量的關聯性、質量分布規律分析 根據表2含量測定結果,繪制3種黃酮苷元含量分布曲線。見圖2,由圖2可知,3種黃酮苷元呈現規律的分布,各成分含量大小趨勢為:槲皮素>山柰酚>異鼠李素,槲皮素與山柰酚比值為(2.56±1),槲皮與異鼠李素的比值為(3.22±1)。

圖2 3種黃酮苷元分布曲線

根據表2含量測定結果,采用SPSS 19進行分析,總黃酮含量、總酚含量之間顯著相關(線性回歸方程:總酚含量=總黃酮含量×11.586+0.014),而酚酸類含量、總酚含量之間不相關;即三七總酚含量隨著總黃酮含量升高而升高,說明黃酮類對總酚的貢獻度較大,三七中酚類成分以黃酮為主,因此,采用黃酮類含量和為指標,即可初步評價三七藥材質量。由表2可知,黃酮類含量和最大相差約7.07倍,含量從高到低排序為:批次6>1>14>5>4>12>11>10>3>2>9>8>15>7>13。將黃酮類含量和最高的批次6設為100,其余批次按比例換算,得圖3;由圖3可知,批次6、1為前30%優質藥材,其黃酮類含量和不得低于0.014%；批次14、5、4、12、11、10為30%～50%良好藥材,其黃酮類含量和不得低于0.008%；批次3、2、9、8、15、7為50%～80%普通藥材,其黃酮類含量和不得低于0.005%。

2.2.3.2 關聯度分析 將表3中15個三七藥材中酚類成分含量相對比值與參比藥材樣品相對比值的比值進行關聯分析,得圖4,表4。

圖3 三七質量分布

圖4 15個三七藥材中酚類成分含量相對比值與參比藥材對應成分含量相對比值的比值

圖4中不同顏色的矩形條代表各藥材中有效指標性成分含量與類型成分含量相對比值與參比藥材對應成分含量相對比值的比值,矩形條大小與參比藥材中相同顏色的矩形條大小越相近,代表該藥材有效指標性成分含量與類型成分含量比值與參比藥材越接近,即質量表征關聯密切。由圖可知,批次3、1、12、11與參比藥材質量表征關聯密切。15個批次的樣品與參比藥材含量相對比值的比值差值的絕對值之和,即非關聯系數;非關聯系數與有效指標性成分的數目的比值,即非關聯度,進而得到關聯度,以反映藥材質量之間的關聯性。見表4。由表4可知,關聯度由高到低排序為:14(0/100)>3(0.3245/95.36)>1(0.6513/90.7)>12(0.711/89.84)>11(0.8261/88.2)>4(0.9144/86.94)>6(0.9805/85.99)>15(1.2418/82.26)>5(1.2582/82.03)>10(1.4378/79.46)>7(1.6044/77.08)>2(1.8935/72.95)>9(2.4507/64.99)>8(3.1941/54.37)>13(5.2679/24.74)。即樣品3、1、12、11、4、6與參比藥材的關聯度較高。

3 討論

三七中酚類成分含量較低,富集之前無法檢測,故本文采用聚酰胺對三七酚類成分進行富集,然后用HPLC法分別對酸水解前后的酚類部位進行檢測,在360 nm下,僅可檢測到黃酮類色譜峰,在260 nm下,酚酸類、黃酮類均有較強吸收,且色譜峰信息較多,故選用260 nm為測定波長。結果發現,酸水解前,可以檢測到黃酮類、酚酸類成分色譜峰,但未檢測到槲皮素、山柰酚、異鼠李素,酸水解后,原黃酮類色譜峰消失,均轉化為槲皮素、山柰酚、異鼠李素3種苷元。見圖5;說明三七中黃酮類成分以苷的形式存在,其苷元主要為槲皮素、山柰酚、異鼠李素,因此測定3種黃酮苷元的含量,即可表征三七中黃酮類含量。

圖5 酸水解前后黃酮類成分變化

中藥質量與其所含有效化學成分類型及存在的量、組成比例等有關。本文在自然藥學觀相關理論的指導下[28-32],運用相關中藥藥物質量表征關聯評價模式[18-28],對15個不同批次的三七藥材樣品的質量進行表征,從而篩選出優質、良好、普通飲片,并以經過藥效驗證的藥材為參比藥材,進行質量關聯度分析比較,確定出批次3、1、12、11、4、6與參比藥材14關聯度最高,綜合質量表征及關聯分析結果,得出批次1、6質量最佳,其次為批次3、12、11、4。本文綜合精準評價出三七藥材質量的優良度,即綜合考量了三七應用有效性及質量關聯性,從而為三七資源篩選及其藥物的原料質量控制和應用提供了依據,亦為其他中藥藥材及其飲片的質量評價提供了研究借鑒。

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(2016-01-14收稿 責任編輯：王明)

Quality Representation of Characteristic Chromatogram and Correlation Analysis of Phenolic Components in Panax notoginseng

Yang Yuan1, Chen Wei1, Zhang Fang1, Kong Jing1, Sun Daohan1, Feng Duo1,Yang Shujuan1,Shen Lifeng2, Hu Shaowei1, Zhou Deyong1, Pan Ting1, Jiang Yanyan1，3,Shi Renbing1,3

(1SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2CapitalMedicalUniversity,Beijing100000，China； 3ChineseMedicineQualityControlTechnologyEngineeringCenter,BeijingMunicipalEducationCommittee,Beijing100029,China)

Characteristic chromatogram of Phenolic Components in Panax notoginseng was established by HPLC-PDA method and 9 featured peaks were screened. Their quality correlation was represented by relative retention schedule. Contents of P-hydroxybenzoic acid, quercetin, kaempferol, isorhamnetin and total phenols were determined, taking p-hydroxybenzoic acid as the control content agent. The total phenolic content of Panax notoginseng was determined by spectrophotometry. Quality representation was made with the contents of phenols in Panax notoginseng and their relative ratio. Correlation analysis of content of each phenol in Panax notoginseng was performed to summarize correlation and quality distribution rules among components in Panax notoginseng. The correlation between different batches of medicinal materials and referential materials which had pharmacodynamics validation was analyzed. The optimal Panax notoginseng could be selected based on the results of correlation analysis. This method can fully and accurately control and evaluate the quality of Panax notoginseng.

Panax notoginseng; Characteristic chromatogram; Quercetin; Kaempferol; Isorhamnetin; Total phenols; Correlation analysis

十二五國家科技支撐計劃項目(編號:2012BAI29B06);北京中醫藥大學創新團隊資助項目(編號:2011-CXTD-12)

楊元(1989.01—),男,在讀碩士,研究方向:中藥藥效物質基礎及質量控制方法研究,E-mail:yangyuan501x@163.com

石任兵(1957.12—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向:中藥復方有效物質基礎與藥物創新，E-mail：shirb@126.com;姜艷艷(1980.12—),女,博士,副教授,碩士研究生導師,研究方向:中藥復方有效物質基礎與質量控制方法研究,E-mail:jyyjm1129@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.039