Prdx1通過P38MAPK通路影響肺癌VM的形成*

魏威朱東望孫保存趙秀蘭張艷輝董學易劉芳張丹芳趙楠

·基礎研究·

Prdx1通過P38MAPK通路影響肺癌VM的形成*

魏威①朱東望②孫保存①③趙秀蘭①張艷輝③董學易①劉芳①張丹芳①趙楠①

目的：檢測Prdx1在肺癌中的表達，探討Prdx1對肺癌血管生成擬態（vasculoenic mimicry，VM）形成的影響，并深入研究其影響機制。方法：利用CD31/PAS雙重染色及免疫組織化學法檢測并分析VM及Prdx1的表達關系。將Prdx1表達質粒轉染至肺癌細胞系A549、H1299中，誘導Prdx1外源性升降表達。Western blot檢測轉染前、后Prdx1、EMT相關蛋白（E-cadherin、Vimentin）、VM相關蛋白（VE-cadherin、VEGF）、P38MAPK通路相關蛋白（P38、P-P38）表達變化情況；A549-Prdx1細胞系加入P38MAPK通路的抑制劑SB203580后，檢測（P38，P-P38、VEGF）的表達變化情況；三維，劃痕和侵襲實驗檢測Prdx1對細胞成管、遷移、侵襲能力的影響。結果：Prdx1與患者VM的形成、淋巴結轉移、不良預后密切相關。Prdx1升表達高E-cadherin表達下調，Vimentin表達上調，VE-cadherin、VEGF表達上調，P38MAPK中P38表達不變，P-P38表達上調。細胞的遷移侵襲成管能力顯著增強。Prdx1低表達后與上述結果相反。A549-Prdx1細胞系中加入P38MAPK通路抑制劑SB203580后，VEGF高P-P38隨劑量的增加而降低，而P38總蛋白不變。結論：Prdx1在肺癌中高表達，可能通過P38MAPK通路影響患者VM的形成。

肺癌 Prdx1 VM P38MAPK 上皮間質轉化

血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）是近年來發現的一種存在于惡性腫瘤中的血液供應方式。Maniotis等［1］研究葡萄膜黑色素瘤微循環時發現惡性黑色素瘤細胞通過自身變形，形成可輸送血液的管道結構-VM，其存在與疾病的進展和預后密切相關［2-3］。

P38MAPK信號通路在生物信息活動中發揮重要作用。去甲腎上腺素可以通過激活P38MAPK轉導通路，促進胰腺癌細胞的增殖［4］。抑制P38轉導通路信號的活性，能夠抑制乳腺癌的浸潤和轉移，而P38轉導通路的活化，使細胞更具浸潤性，促進乳腺癌細胞的浸潤和轉移［5］。Prdx1是抗氧化蛋白超家族中的一員，廣泛存在于原核生物和真核生物中，在腫瘤中高表達促進腫瘤增殖與轉移［6］，Taniuchi等［7］報道了Prdx1在胰腺導管腺癌組織中高表達，通過調控P38MAPK信號通路的活性，與磷酸化的P-P38相互作用影響胰腺癌細胞的侵襲。研究發現Prdx1在肺癌中高表達［8］，但在肺癌中Prdx1是否可以通過P38MAPK通路影響腫瘤侵襲、轉移并且影響VM形成的研究尚少。本研究旨在探討肺癌組織中Prdx1影響VM形成的可能分子機制為肺癌的診斷、治療提供新的思路和有效途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本選取天津醫科大學腫瘤醫院和天津醫科大學總醫院1990年10月至2010年11月經手術切除病理診斷為肺癌并且隨訪資料完整的患者標本101例。

1.1.2細胞株人肺癌細胞A549，H1299為天津醫科大學病理學實驗室自存。

1.1.3實驗試劑RPMI 1640購自美國Neuronbc公司，胎牛血清購自中國Thermo公司。Prdx1表達質粒購自美國GeneCopoeia公司（catalog no.HSH065845-LVRU6GP）。慢病毒包裝試劑盒購自美國GeneCo?poeia公司（catalog no.HPK-LvTR-20）。Transwell小室購自美國FALCON公司。兔抗人多克隆抗體Prdx1、兔抗人單克隆抗體E-cadherin兔抗人多克隆抗體Vimentin兔抗人多克隆抗體VE-cadherin均購自美國Abcam公司。兔抗人多克隆抗體P38、P-P38均購自美國Cell Signaling Tecenology公司，P38MAPK抑制劑SB203580購自美國Selleck公司。兔抗人多克隆抗體β-actin、VEGF、PV6000通用二步法免疫組化試劑盒、山羊抗兔IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色肺癌組織石蠟包塊4 μm連續切片常規脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；微波熱修復；正常血清室溫封閉，一抗4℃過夜，次日孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，封片。PBS代替一抗作為陰性對照。染色結果判斷標準：用染色強度和陽性細胞百分比積分來評價。染色強度：0為陰性；1為淺黃色；2為深黃色；3為棕黃色。陽性細胞百分率：每例標本選擇10個含有陽性細胞的高倍視野（×400）分別計數100個腫瘤細胞，取其平均值，計算陽性細胞百分率：0為無陽性細胞；1為陽性細胞≤25%；2為陽性細胞≤50%；3為陽性細胞＞50%。染色指數為陽性細胞百分率和染色強度之和，最小值為0，最大值為6。染色指數＞4定為免疫組織化學染色陽性；染色指數≤4定為陰性。

1.2.2CD31/PAS雙染免疫組織化學染色后將切片置于0.5%過碘酸溶液中常溫孵育10 min，蒸餾水浸洗5遍，滴加Schiff試劑，37℃孵育15～30 min。流水沖洗，蘇木素復染細胞核，封片。CD31陽性為血管內皮細胞胞膜著色，呈棕黃色。PAS為膠原著色，呈櫻桃紅色。VM由經過塑形的腫瘤細胞而非內皮細胞圍成，無CD31著色，但內襯PAS陽性環，管腔內可見血紅細胞存在。

1.2.3細胞系和培養條件A549、H1299肺癌細胞系在含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中，放入37℃、5%CO2恒濕孵化箱中孵育，待細胞融合約90%時，傳代以保持細胞的活力。

1.2.4細胞轉染細胞培養至70%～80%匯合時轉染，轉染前更換為無血清、無抗生素的新鮮培養液。以1:2比例混勻病毒液和不完全培養基，24 h后更換為完全培養基。轉染48 h后進行轉染效果評價并加入嘌呤霉素篩選穩定表達Prdx1的細胞株。

1.2.5細胞劃痕實驗將細胞接種于6孔板，于37℃孵箱中培養；待培養細胞生長至80%時，用100 μL移液槍頭在細胞表面劃痕，并在倒置顯微鏡下觀察，拍照記錄劃痕間初始距離（0 h）；在24、48，72 h后，拍照記錄劃痕間的距離，計算細胞的相對遷移率；實驗重復3次。

1.2.6細胞侵襲實驗將Transwell小室包被Matirgel膠并在培養箱中過夜，次日消化細胞并用無血清的RPMI 1640培養液重懸，將細胞懸液接種于上室，下室用完全培養基，培養48 h后取Transwell小室，PBS洗3遍，甲醇固定，結晶紫染色，分析穿透能力。

1.2.7三維成管實驗將96孔板包被Matirgel膠并在培養箱中過夜，次日消化細胞并以合適的密度接種于96孔板重懸，于37℃孵箱中培養，在倒置顯微鏡下觀察成管能力，并拍照記錄。

1.2.8Western blot法檢測用細胞裂解液RI?PA-SDS裂解細胞，提取其總蛋白，在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。PVDF膜轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉室溫1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，次日恢復室溫孵育相應二抗2 h，TBST漂洗，加入發光液顯影、定影、照像。1.2.9加入P38MAPK通路抑制劑SB203580懸浮細胞貼壁后，饑餓12 h，加入SB203580抑制劑，濃度分別為0、5、10、15、20 μM，48 h候提取蛋白，Western blot檢測。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件包進行分析。計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。采用Kaplan-Mei?er方法進行生存分析，生存率比較采用Log rank檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1Prdx1的表達及與VM、肺癌患者臨床病理資料的關系

免疫組織化學染色結果顯示，Prdx1陽性表達產物呈棕黃色，主要定位于肺癌細胞漿（圖1）。CD31/PAS雙染結果顯示，內皮依賴性血管是由CD31陽性的血管內皮細胞圍成，管腔內可見紅細胞，VM是由腫瘤細胞圍成的管腔樣結構，管腔內存在紅細胞，管腔周圍無出血壞死及炎細胞浸潤且內襯PAS陽性環（圖2）。在101例肺癌標本中，Prdx1陽性表達64.36%（65/101）。分析Prdx1的表達與肺癌患者臨床病理資料的關系顯示，Prdx1在VM陽性患者中表達高于VM陰性患者，差異具有統計學意義（χ2=12.250，P=0.007）。Prdx1在淋巴結轉移患者中表達明顯高于無淋巴結轉移患者，差異具有統計學意義（χ2=20.870，P＜0.001）。而Prdx1在不同性別、腫瘤大小、臨床分期中差異無統計學意義（P＞0.05，表1），生存分析結果顯示，Prdx1陽性組較Prdx1陰性組的生存時間短，差異具有統計學意義（P=0.037）。

圖1 Prdx1在肺癌組織中定位于細胞漿的陽性表達及Prdx1在肺癌組織中的陰性表達（IHC×400）Figure 1Representative Prdx1-positive lung cancer samples illustrating that staining mainly localized in the cytoplasm and Prdx1-negative lung cancer samples exhibiting almost no appreciable staining(IHC×400)

圖2 人肺癌組織中存在VM及內皮血管Figure 2VM and endothelial-dependent vessel in lung cancer tissues

表1 Prdx1與肺癌臨床病理資料的關系Table 1Correlation between Prdx1 with VM and clinicopathologic data of lung cancer patients

2.2A549、H1299細胞系轉染Prdx1后細胞遷移、侵襲、細胞成管能力的變化

實驗結果表明，與未轉染組相比，細胞遷移、侵襲、細胞成管能力顯著改變，差異具有統計學意義（P＜0.05），Prdx1可以影響細胞的遷移、侵襲、細胞成管能力。

2.3A549、H1299細胞系轉染Prdx1表達質粒后Prdx1、E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、VEGF、P38、P-P38的表達變化

利用Western blot檢測轉染前、后A549、H1299細胞中Prdx1、E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、VEGF、P38、P-P38的表達變化情況。結果顯示，轉染Prdx1后，A549-Prdx1細胞Prdx1表達明顯升高，H1299-shPrdx1細胞Prdx1表達明顯降低，提示轉染成功。高表達Prdx1后可以使A549細胞系E-cadherin表達下調，Vimentin上調，VE-cadherin、VEGF、P-P38的表達上調，P38表達不變。低表達Prdx1后，在H1299細胞系中上述指標與之相反（圖3A）。結果說明Prdx1可能通過調控低E-cadherin的表達參與EMT促進肺癌的轉移，可能通過調控VE-cadherin、VEGF的表達影響VM的形成，P-P38表達水平的改變說明P38MAPK可能參與了肺癌VM的形成。

2.4A549-Prdx1細胞系加入P38MAPK抑制劑SB203580檢測P38、P-P38、VEGF的表達變化

利用Western blot檢測P38、P-P38、VEGF的表達情況，結果顯示加入SB203580抑制劑后，P38總蛋白保持不變，P-P38、VEGF隨劑量的增高而降低（圖3B）。結果說明P38MAPK通路可以調控VEGF的變化。

圖3 Western blot檢測相關蛋白的表達變化Figure 3Changes in related protein expression detected by Western blot

3 討論

全球肺癌的發病率和死亡率均呈上升態勢，尤其在中國等經濟發展中國家，肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一［9-10］，大多數患者在就診時已經處于中晚期或者轉移狀態，患者生存質量較低［11］，因此深入研究肺癌患者的侵襲、轉移機制至關重要。VM是高侵襲性腫瘤為了滿足自身的血液供應，癌細胞通過自身變形和細胞外基質重塑而圍成的一種類血管樣的管道，是一種不依賴血管內皮細胞的一種腫瘤微循環模式，并與宿主血管相連，獲取血供，從而使腫瘤細胞侵襲轉移能力增強。

Prdx1屬于抗氧化蛋白超家族中的一員［12］，在氧化應激條件下在一些惡性腫瘤細胞中高表達，除了抗氧化功能之外，其與腫瘤的增殖分化、細胞信號轉導、侵襲轉移密切相關［13］，在實體腫瘤中高表達，如乳腺癌［14］、膽管癌［15］、舌鱗癌［16］等。有關Prdx1在肺癌中影響腫瘤VM形成的研究較為少見。P38MAPK通路是細胞內復雜信號網絡中一條重要的信號轉導途徑，在細胞各個病理生理過程中均發揮作用［17］，P38MAPK信號轉導通路通過影響VEGF的表達而在腫瘤血管新生、侵襲和轉移方面起重要的調控作用［18］。目前已有研究證明Prdx1可以調控P38MAPK通路影響腫瘤的生物活動。Turner-Ivey等［19］發現在乳腺腫瘤中，Prdx1能夠促進MKP-5活化、抑制p38MAPKα，從而減少腫瘤細胞的凋亡。Du等［20］證明了Prdx1能夠與ASK1相互作用，抑制ASK1的活性，進而抑制ASK1介導的JNK、P38MAPK信號通路，減少腫瘤細胞凋亡。有文獻報道了Prdx1在胰腺導管腺癌組織中高表達，且與磷酸化的P-P38相互作用，并發現Prdx1可以導致膜波動和突起的改變，從而影響胰腺癌細胞的侵襲［7］，本研究推測Prdx1可能通過P38MAPK通路影響VM的形成。

本實驗用CD31/PAS雙染和免疫組織化學方法檢測并分析肺癌組織中VM與Prdx1的關系，分析Prdx1與臨床病理資料的關系。結果顯示Prdx1在肺癌中高表達，并與VM、淋巴結轉移、不良預后密切相關，提示Prdx1可能與肺癌的高侵襲能力有關。功能實驗驗證了上調組細胞系與對照組相比其遷移、侵襲、VM管狀結構形成能力明顯增強。在此基礎上，將Prdx1外源性轉入肺癌細胞，結果發現與對照組相比A549-Prdx1細胞系中上皮標志物E-cadherin表達明顯降低，間質表型標志物Vimentin升高，說明Prdx1可以導致細胞間的黏附連接和緊密連接破壞，促使腫瘤細胞轉移與侵襲。VE-cadherin和VEGF是VM的重要標志物，VE-cadherin是一種表達于內皮細胞之間的跨膜性黏附蛋白，介導細胞與細胞間互相黏附；VEGF與腫瘤生長、轉移、侵襲有關，是與腫瘤血管生成密切相關的因子，過表達Prdx1可以使VE-cadherin和VEGF表達增高；而P38MAPK通路中PP38表達升高，P38總蛋白的表達不變，提示Prdx1可能通過影響下游磷酸化水平調控P38MAPK信號通路。而在下調組中，上述結果與之相反。在加入P38MAPK通路的抑制劑SB203580后，P-P38表達隨劑量增高而降低，與VEGF表達呈現正相關，而P38表達不變，驗證了P38MAPK信號轉導通路通過影響VEGF的表達而在VM形成中的作用。以上實驗說明Prdx1可以促進腫瘤細胞在體外的遷移、侵襲、VM管狀結構形成能力，進而影響細胞侵襲、轉移，通過P38MAPK通路可能影響VM的形成。

本研究在體內和體外兩個水平上驗證了Prdx1對肺癌VM形成的影響，也間接表明了P38MAPK信號通路在肺癌VM形成中的作用。研究肺癌中VM形成的可能分子機制，找到并抑制能促進VM形成的信號分子，為肺癌的診斷、治療提供了新的思路和有效途徑。但是Prdx1在肺癌中促進腫瘤轉移的內在機制很復雜，P38MAPK通路可能只是其中的某一個環節，因此Prdx1在肺癌VM形成過程中的其他作用機制，還需要進一步探討。

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（2016-08-12收稿）

（2016-10-18修回）

Prdx1 promotes vasculogenic mimicry formation of lung cancer via P38MAPK signaling

Wei WEI1,Dongwang ZHU2,Baocun SUN1,3,Xiulan ZHAO1,Yanhui ZHANG3,Xueyi DONG1,Fang LIU1,Danfang ZHANG1,Nan ZHAO1Correspondence to:Baocun SUN;E-mail:baocunsun@aliyun.com

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Stomatological Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This study was supported by the Key Project of the National Natural Science Foundation of China(Nos.81230050 and 81572872)

Objective:To analyze the effect of Prdx1 on lung cancer by investigating its expression and role in vasculogenic mimicry (VM)formation.Methods:The relationship between VM existence and Prdx1 expression was detected and analyzed by CD31/PAS dual staining and immunohistochemical staining.A549 and H1299 cells were transfected with Prdx1-expressing plasmids to induce exogenous Prdx1 protein expression.Changes in the expression levels of Prdx1,EMT-related proteins(E-cadherin and Vimentin),VM-related proteins(VE-cadherin and VEGF),and P38MAPK signaling-related proteins(P38 and P-P38)were detected by Western blot after transfection.Furthermore,changes in the expression levels of P38MAPK signaling-related proteins(P38 and P-P38)and VM-related protein (VEGF)in A549-Prdx1 cells were detected by Western blot after using SB203580.The effects of Prdx1 gene transfection on migration capacity were determined by an in vitro wound-healing assay,whereas the role of Prdx1 transfection in invasive potential was determined by an invasion assay.The role of Prdx1 transfection on tube structure formation potential was determined by three-dimensional culture.Results:Immunohistochemistry staining showed that Prdx1 expression was positively associated with VM,metastasis,and poor prognosis.Western blot showed that after Prdx1 was increased,E-cadherin expression was downregulated,whereas Vimentin, VE-cadherin,VEGF,and P-P38 expression levels were upregulated in A549 cells.Moreover,P38 expression was unchanged.Wound healing,invasion,and three-dimensional culture assays showed that the migration,invasion,and tube structure formation potentials of A549 cells significantly increased,whereas suppressing Prdx1 in H1299 cells yielded the opposite results.After adding the P38MAPK pathway inhibitor,VEGF and P-P38 expression levels decreased as inhibitor dosage increased,whereas P38 expression remained the same.Conclusion:Prdx1,which is highly expressed in lung cancer specimens,was closely associated with VM.This association may promote VM formation via P38MAPK signaling.

lung cancer,Prdx1,VM,P38MAPK,EMT

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.22.947

①天津醫科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫科大學口腔醫院口腔頜面外科；③天津醫科大學腫瘤醫院病理科

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）和國家自然科學基金面上項目（編號：81572872）資助

孫保存baocunsun@aliyun.com

魏威專業方向為腫瘤病理學。

E-mail：weiwei_91223@163.com