脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究

楊 雪， 李云亮， 王禹程， 黃姍芬， 馬海樂

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 江蘇鎮(zhèn)江 212013)

Note:* stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:* stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

Note: * stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

Note:* stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).

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脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究

楊 雪， 李云亮， 王禹程， 黃姍芬， 馬海樂*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 江蘇鎮(zhèn)江 212013)

[目的]通過對(duì)大鼠的90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)脫毒菜籽多肽的食用安全性。[方法]將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，分別為低、中、高劑量組和對(duì)照組。試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼料中添加1.65、3.30和6.60 g/kg脫毒菜籽多肽，按80 g/kg的日攝入量以自由采食的方式喂養(yǎng)大鼠90 d，觀察脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率、血清學(xué)、臟器系數(shù)以及組織病理學(xué)等指標(biāo)的影響。[結(jié)果]與對(duì)照組相比，各劑量組大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率、臟器絕對(duì)重量和臟體比均無顯著差異(P>0.05)，大鼠血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)值、生化指標(biāo)檢測(cè)值均在正常范圍內(nèi)；高劑量組各大鼠臟器均未出現(xiàn)明顯的組織病理變化。[結(jié)論]脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、血漿、生化功能及臟體比等指標(biāo)均未見不良影響。

脫毒菜籽多肽；喂養(yǎng)試驗(yàn)；組織學(xué)檢查；血液學(xué)指標(biāo)；血清生化指標(biāo)

我國(guó)是菜籽粕生產(chǎn)第一大國(guó)，每年可產(chǎn)800萬(wàn)t以上[1]，且價(jià)格較低，期貨價(jià)格在2 500元/t上下波動(dòng)。菜籽蛋白占菜籽餅粕的30%以上，為全價(jià)蛋白質(zhì)，且其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與大豆蛋白和酪蛋白相接近[2-3]，含有豐富的人體必需氨基酸，是一種理想的、潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值[4-5]，精深加工菜籽蛋白已成為充分利用優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的新熱點(diǎn)。

由于菜籽餅粕中的一些有毒成分和抗?fàn)I養(yǎng)成分的存在，包括硫甙及其代謝衍生物、植酸、單寧和芥子堿等，影響了其蛋白質(zhì)的消化吸收及利用。因此，菜籽餅粕只能在飼料中少量添加或脫毒后使用。常見的脫毒方法包括物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法，其中化學(xué)脫毒方法脫毒較為徹底。蘭文菊等[6]研究表明使用硫酸溶液脫毒后菜籽粕中植酸、單寧、硫代葡萄糖苷、異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的脫除率均高于90%，且蛋白質(zhì)含量升高、氨基酸組成基本維持不變。因此，采用酸浸溶法脫毒后的菜籽蛋白，再經(jīng)過堿溶酸沉的方法提取蛋白后可獲得優(yōu)質(zhì)的脫毒菜籽蛋白，目前許多研究者基于脫毒菜籽蛋白制備了具有多種生物學(xué)功能的多肽[7]。

多肽是比蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單、分子量小、由氨基酸通過肽鏈相連的一類化合物，具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)的雙重功效，它幾乎影響著人體的所有代謝合成[8]。研究表明，某些多肽不僅能提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且具有防病治病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效，具有一些原食品蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所不具備的獨(dú)特的生物活性[9-10]。利用酶解或水解法制備菜籽多肽是開發(fā)與利用菜籽蛋白資源的重要途徑之一[11-12]。然而，長(zhǎng)期食用脫毒后的菜籽多肽是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副作用還有待進(jìn)一步探索。筆者通過大鼠的90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，研究了脫毒菜籽多肽對(duì)動(dòng)物機(jī)體的亞慢性毒性，旨在為脫毒菜籽多肽作為保健食品進(jìn)行開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脫毒菜籽多肽。脫毒菜籽多肽購(gòu)自江蘇天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。

1.1.2 主要儀器和試劑。生化試劑盒；自動(dòng)生化分析儀、血細(xì)胞分析儀、病理切片機(jī)、離心機(jī)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。4周齡健康SD大鼠，雌雄各48只，共90只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，清潔級(jí)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境設(shè)施的使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2012-0037號(hào)，雌雄大鼠進(jìn)室適應(yīng)3 d后分性別按體重分成4組，每組12只，均單籠飼養(yǎng)，無菌水自由飲用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及受試物劑量。脫毒菜籽多肽推薦劑量為22.00 mg/kg，設(shè)置高劑量組(6.6 g/kg)以及中劑量組(3.30 g/kg)和低劑量組(1.65 g/kg)。分別稱取82.500、41.250和20.625 g脫毒菜籽多肽拌入滅菌基礎(chǔ)鼠飼料(購(gòu)自蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司，合格證號(hào)為蘇飼審(2009)05032號(hào))，按80 g/kg 的日攝入量給予大鼠自由食用，飼養(yǎng)90 d。

1.2.2 生長(zhǎng)發(fā)育情況觀察。每天觀察大鼠的排便、進(jìn)食及活動(dòng)等情況2次，視納食情況調(diào)整喂食量，每7 d稱1次體重和2次食物攝入量，計(jì)算每周及總的食物利用率及實(shí)際平均每天攝入受試物的劑量。

1.2.3 樣本采取及測(cè)定指標(biāo)。飼養(yǎng)中期對(duì)大鼠內(nèi)呲靜脈采血，測(cè)其血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞總數(shù)及分類，結(jié)束時(shí)取血，進(jìn)行大體解剖檢查，取臟器稱重，固定并保存。對(duì)大鼠血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞總數(shù)及分類、腦、心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、卵巢絕對(duì)重量和臟體比、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)進(jìn)行測(cè)定，90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行大體解剖，并對(duì)其腦、心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胃、十二指腸、睪丸、卵巢、子宮進(jìn)行組織切片病理學(xué)檢查。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)均使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差不齊先進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，仍不齊改用秩和檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育 90 d喂養(yǎng)期間，各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，皮毛濃密有光澤，飲食、行為、精神狀態(tài)等未見異常，試驗(yàn)期間無1例動(dòng)物死亡。

2.2 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠體重的影響 試驗(yàn)開始前測(cè)定大鼠始重，并于試驗(yàn)開始后測(cè)定每周大鼠的體重。由表1可知，各劑量組雌雄不同時(shí)間大鼠的體重與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。這說明不同用量的脫毒菜籽多肽對(duì)雄性和雌性大鼠均無毒性。

表1 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠體重的影響

2.3 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠進(jìn)食量和食物利用率的影響 由表2和表3可知，43～49 d因喂養(yǎng)過程中期對(duì)大鼠內(nèi)眥靜脈采血測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)，導(dǎo)致試驗(yàn)組與對(duì)照組雌雄大鼠的食物利用率均出現(xiàn)下降現(xiàn)象。此外，其他組雌雄大鼠每周進(jìn)食量及總進(jìn)食量、每周食物利用率及總食物利用率與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表2 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠每周進(jìn)食量和總進(jìn)食量的影響

2.4 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類的影響 分別于試驗(yàn)中期和末期，通過對(duì)大鼠內(nèi)呲靜脈采血測(cè)定血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞總數(shù)及分類。由表4和表5可知，喂養(yǎng)中期低劑量組、高劑量組雄性大鼠HGB降低，喂養(yǎng)末期高劑量組雄性大鼠的血小板計(jì)數(shù)(PLT)升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，但數(shù)值均在正常范圍內(nèi)[13-14]，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，故不認(rèn)為具有生物學(xué)意義。其他劑量組各指標(biāo)與對(duì)照組相比，均無顯著差異(P>0.05)。

由表6和表7可知，喂養(yǎng)中期、喂養(yǎng)末期雌雄大鼠白細(xì)胞分類的有些指標(biāo)與對(duì)照值相比差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)，但數(shù)值均在正常值范圍內(nèi)[13-14]，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，故不認(rèn)為具有生物學(xué)意義。其他劑量組各指標(biāo)與對(duì)照組相比，均無顯著差異(P>0.05)。

表3 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠食物利用率的影響

表4 脫毒菜籽多肽對(duì)喂養(yǎng)中期大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

注：*表示與對(duì)照組雄性大鼠相比差異顯著(P<0.05)；**表示與對(duì)照組雄性大鼠差異極顯著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

表5 脫毒菜籽多肽對(duì)喂養(yǎng)末期大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

注：**表示與對(duì)照組雄性大鼠差異極顯著(P<0.05)。

Note:**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

%

注：*表示與對(duì)照組雌性大鼠差異顯著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

2.5 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 試驗(yàn)結(jié)束后采血，測(cè)定大鼠的血清生化指標(biāo)。由表8可知，與對(duì)照組相比，低劑量組雌性大鼠的血糖(GLU)升高，低、中劑量組雄性大鼠的總蛋白(TP)降低，低劑量組雄性大鼠的白蛋白(ALB)降低，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05,P<0.01)，但數(shù)值均在正常范圍內(nèi)[13-14]，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，故不認(rèn)為具有生物學(xué)意義。其他劑量組雌雄大鼠的生化指標(biāo)與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

%

注：*表示與相同性別對(duì)照組大鼠差異顯著(P<0.05)；**表示與相同性別對(duì)照組大鼠差異極顯著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

表8 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

注：*表示與相同性別對(duì)照組大鼠差異顯著(P<0.05)；**表示與相同性別對(duì)照組大鼠差異極顯著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).

2.6 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠臟器絕對(duì)重量和臟器比的影響 試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行大體解剖檢查，取臟器稱重，固定、保存，分別測(cè)定大鼠臟器絕對(duì)重量和臟器比。由表9和表10可知，各劑量組雌雄大鼠臟器絕對(duì)重量、臟體比與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表9 脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠臟器絕對(duì)重量的影響

%

2.7 大體解剖和組織學(xué)檢查 對(duì)大鼠進(jìn)行大體解剖，對(duì)照組出現(xiàn)1例雄鼠局部肝細(xì)胞輕度脂肪變性、1例雌鼠肺左葉局部血管輕度充血，局部間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、1例雄鼠腎上腺皮質(zhì)區(qū)束狀帶細(xì)胞輕度空泡變性。高劑量組出現(xiàn)1例雄鼠局部心肌炎細(xì)胞浸潤(rùn)、1例雄鼠局部肝細(xì)胞輕度脂肪變性、雌鼠1例肺左葉局部間質(zhì)輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，雌鼠1例左肺局部間質(zhì)血管輕度出血。此外，對(duì)照組和高劑量組大鼠的大腦、小腦、脾臟、腎、胸腺、胃、十二指腸、卵巢、子宮睪丸均未見明顯異常。

2.8 各試驗(yàn)組大鼠實(shí)際攝入受試物劑量 通過90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算大鼠平均每天受試物的攝入量。由表11可知，雌性大鼠平均每天受試物的攝入量略高于設(shè)定的劑量，而雄性大鼠則略有降低。

表11 大鼠實(shí)際攝入脫毒菜籽多肽劑量

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，菜籽多肽具有多種生物學(xué)活性，除了降血壓[15-17]、清除體內(nèi)自由基、具有抗氧化作用[18-19]外，菜籽多肽還具有醒酒[20]、抗凝血[21]、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力[22]等功能。經(jīng)過脫毒后的菜籽蛋白是一種非常好的資源，長(zhǎng)期服用菜籽多肽是否具有毒性尚未確定。為探討脫毒菜籽多肽長(zhǎng)期服用的安全性，筆者通過90天喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)脫毒菜籽多肽的亞慢性毒性進(jìn)行了研究，觀察了受試物以不同劑量水平經(jīng)長(zhǎng)期喂養(yǎng)后對(duì)動(dòng)物的毒性作用性質(zhì)和靶器官，并初步確定最大無毒副作用劑量。該試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)期內(nèi)各劑量組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，體重增重、食物利用率、血常規(guī)、血生化、臟器系數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，與對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,經(jīng)病理組織學(xué)檢查，各劑量組也未發(fā)現(xiàn)受試物質(zhì)造成的病理學(xué)改變和損傷。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，脫毒菜籽多肽對(duì)大鼠90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)均未見明顯毒性反應(yīng),最大無作用劑量為6.6 g/kg,已達(dá)到人體推薦每日攝入量的300倍。在該試驗(yàn)條件下長(zhǎng)期服用脫毒菜籽多肽對(duì)機(jī)體并無明顯不良反應(yīng)，但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類的局限性和試驗(yàn)時(shí)間的限制，對(duì)脫毒菜籽多肽食用安全性的評(píng)價(jià)還需要進(jìn)行更加深入和長(zhǎng)期的試驗(yàn)研究。參考文獻(xiàn)

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Study on Subchronic Toxicity of Detoxification Rapeseed Peptide on Rats

YANG Xue,LI Yun-liang,WANG Yu-cheng,MA Hai-le*et al

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] To access sinchronic toxicity of detoxification rapeseed peptides,ninty days feeding study of rats were researched.[Method] Experimental animals were divided into four groups,including low-dosage,middle-dosage and high-dosage group and control group.According to the daily free feed intake of 80 g/kg, basic feed in experimental group were added with 1.65,3.30,6.60 g/kg dose detoxification rapeseed peptides respectively,for 90 days to observe effects of detoxification rapeseed peptides on rat weight,feed intake,food utilization rate,serology indexes,organ coefficient and tissue pathology.[Result]Compared with control group,there were no significant difference (P>0.05) of weight,feed intake,food utilization rate,absolute visceral organ weight and organ/body weight ratio in each dosage group,and hematology and biochemical index of rats were within normal range; In high-dosage group,there was no obviously histopathologic change of rat visceral organ.[Conclusion] Detoxification rapeseed peptides had no adverse effects on the growth and development,plasma,biological function,organ/body weight ratio of rats.

Detoxification rapeseed peptide;Feeding test;Histological examination; Hematology index; Blood biochemical index

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102203)；江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(16JDG049)。

楊雪(1989- )，女，河北承德人，博士研究生，研究方向：多肽提取與功能評(píng)價(jià)。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事功能食品、食品物理學(xué)加工方法及裝備開發(fā)研究。

2016-08-31

S 865.1

A

0517-6611(2016)33-0148-05