乳糖乳桿菌的培養條件優化研究

馬燕，謝式云，易永紅，金樁，陳俊波

（1.羅牛山股份有限公司，海南海口570125；2.海南羅牛山畜牧有限公司，海南海口570100；3.海南職業技術學院，海南海口570126）

乳糖乳桿菌的培養條件優化研究

馬燕1，謝式云1，易永紅1，金樁2，陳俊波3

（1.羅牛山股份有限公司，海南海口570125；2.海南羅牛山畜牧有限公司，海南海口570100；3.海南職業技術學院，海南海口570126）

研究通過單因子優化和正交試驗對乳糖乳桿菌培養條件進行初步的優化。結果表明，乳糖乳桿菌屬于厭氧菌，在改良MRS培養基中培養最佳條件是：溫度為35℃，培養時間為48 h，初始pH為9.0，接種量為2.0%；乳糖乳桿菌最適合生長培養基成分為蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2.15 g，Tween 80 1 mL，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.58 g，四水硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。此時OD值能達到1.638，活菌數能達到1.88×109cfu/mL。

乳糖乳桿菌；培養條件；培養基成分；優化；OD值；活菌數

從20世紀60年代開始人們發現在動物飼養業中使用抗生素的種種弊端。由于在飼料中抗生素的廣泛應用，導致動物胃腸道正常菌群失調，產生耐藥性和藥物殘留等副作用，給動物和作為動物產品消費者的人類健康都帶來了危害[1-2]。于是人們關注和尋找能夠克服上述弊端的抗生素替代物，乳糖乳桿菌制劑就是其中一種重要的研究對象[3]。大量研究表明，乳酸菌具有改善飼料適口性，調節腸道菌群，抑制腸道內腐敗菌生長繁殖，消除體內有毒物質的產生，改善便秘、肝功能和維生素代謝，提高免疫功能等作用[4-6]。但是，在實際生產中乳酸菌制劑的飼用效果不完全一致[7-9]。筆者認為，目前乳酸菌制劑生產還沒有國家標準，市場上的產品質量不穩定，進而影響產品使用效果。本研究對飼用乳糖乳桿菌的培養條件進行了優化研究，給乳酸菌發酵飼料的標準化生產提供優質一級菌種。

1 材料和方法

1.1 試驗時間與地點

2016年5—6月在羅牛山股份有限公司博士后科研工作站實驗室進行試驗。

1.2 菌種

由羅牛山股份有限公司博士后科研工作站菌種保藏中心提供。

1.3 試驗設備

振蕩培養箱（SHZ-A型，上海躍進醫療機械廠）；生化培養箱（DHP120型，上海實驗儀器總廠）；高壓滅菌器（MLS-3750型，日本三洋電子有限公司）；磁力攪拌器（JB-3型，上海智光儀器儀表有限公司）；便攜式pH計（PHB-3型，上海偉業儀器廠）；生物潔凈工作臺（SA-960-2型，上海上凈凈化設備有限公司）；721可見紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.4 培養基

種子培養基（MRS培養改良基）[10]：蛋白胨10 g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸銨2.15g，Tween801mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.05 g，K2HPO42 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

1.5 培養條件優化

菌種活化：從冰箱中取出乳糖乳桿菌斜面菌種，室溫靜置活化40 min。而后用接種環取種兩環接種于裝有10 mL MRS改良液體培養基的試管中，37℃靜止培養12 h，備用。

1.5.1 靜置培養和搖床培養對比（培養時間X的確定）按1.0%接種量將活化的種子接種于裝有100 mL MRS改良液體培養基的250 mL三角瓶中，37℃靜置培養和60 r/min振蕩培養60 h，每隔12 h取1次樣（先搖勻后取樣），在610 nm處測定培養液OD值。

1.5.2 培養基起始pH的篩選以6 mol/L的HCl或NaOH溶液將MRS改良培養基的起始pH分別調節為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.0，接入1.0%的乳糖乳桿菌活化菌液，37℃下恒溫培養X h，在610 nm處測定菌液OD值。

1.5.3 培養溫度的篩選將100 mL的MRS改良液體培養基中接入1.0%的乳糖乳桿菌活化菌液，分別于30、35、40、45℃下恒溫培養X h，在610 nm處測定菌液OD值。

1.5.4 接種量的確定按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量接乳糖乳桿菌活化菌液后靜置培養X h取樣，測定培養液OD值。

1.6 培養基成分的優化

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影響培養基成本的主要成分。因此，本試驗設計L16（45）正交試驗，確定乳糖乳桿菌培養基成分，試驗設計見表1。

表1 L16（45）正交設計因素

1.7 試驗數據的統計

用Excel 2007對試驗數據進行統計分析和圖表處理。

2 結果與分析

2.1 乳糖乳桿菌靜置培養和搖床培養對比及培養時間的確定

從表2和圖1可知，靜置和搖床培養的菌液起始OD值一樣，隨著培養時間的延長OD值逐漸變大。靜置和搖床培養在0～12 h內生長比較緩慢，12～48 h內生長較快，菌種生長進入對數生長期，48 h時OD值幾乎接近峰值，靜置培養可以達到1.260，優于搖床培養，48 h后逐漸接近平穩。試驗結果說明，乳糖乳桿菌是厭氧菌，符合乳酸菌多數屬于厭氧菌或微好氧菌的結論[11]，該乳糖乳桿菌的最佳培養時間是48 h。

表2 靜置和搖床培養乳糖乳桿菌菌液OD值對比

圖1 靜置和搖床培養乳糖乳桿菌菌液OD值對比

2.2 培養基起始pH的確定

將乳糖乳桿菌接種于不同起始pH的培養基中靜置培養48 h，測定菌液OD值結果見表3。從表3可以看出，乳糖乳桿菌對酸堿環境的適應能力較強，pH 4.5～9.0都可以生長。當pH小于5.5或大于8.5時生長較好，而在pH 5.5～7.5范圍內生長較慢。pH 4.5與pH 9.0時生長較好，pH 9.0時OD值達到1.568，相對最高。許多研究表明[12-15]，乳酸菌在pH 4.5～8.0范圍內生長良好。而本試驗結果最適初始pH約在9.0時乳糖乳桿菌生長最好，應該是該菌特性。

表3 不同起始pH乳糖乳桿菌菌液的OD值

2.3 培養溫度的確定

將乳糖乳桿菌培養液分別置于30、35、40、45℃下恒溫培養48 h，測定的OD值結果見表4。

表4 不同溫度下乳糖乳桿菌培養液OD值

從表4可以看出，隨著溫度的提高乳糖乳桿菌菌液的OD值先增高后降低。李艾黎等[16]用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為對象，研究了不同培養溫度（37、42、45℃）對其混合生長的影響。試驗證實培養環境為42℃時，不僅有利于酸奶菌種混合培養時的球桿菌比例平衡，其生長速率也有顯著提高。李志成等[17]以脫脂乳為基礎培養基，選用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種在30、34、37、42℃發酵，研究發酵溫度對凍干酸奶發酵劑活菌數的影響。結果表明，不同發酵溫度下制得的凍干發酵劑活菌數有顯著差異，尤其是在30℃發酵制得的凍干發酵劑其活菌數顯著高于其他發酵溫度，其凍干發酵劑活菌數高達4.2×1011cfu/g。熊素玉等[18]用改良MC培養基為載體，對分離到的24株菌進行最適培養條件的研究。結果表明，最適生長溫度大概在40℃左右，但在各菌株間略有差異。張建國等[19]研究表明，試驗用乳酸菌在40℃時效果略好于20和30℃。張蘭威等[20]研究了培養溫度（38、41、44℃）對保加利亞桿菌嗜熱鏈球菌混合培養的影響。結果表明，較高溫度（44℃）有利于中利亞桿菌生長，且混合培養的總菌數多。即高溫度（44℃）可以促進混合培養中保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌快速生長。綜合上述，乳酸菌最適溫度在30～44℃之間，因菌株不同而各異。本試驗用的飼用乳糖乳桿菌在35與40℃時生長OD值相差不大，根據試驗實際需要，本試驗最終選用35℃作為飼用乳糖乳桿菌的培養溫度。

2.4 接種量的確定

按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量，接種乳糖乳桿菌活化菌靜置培養48 h，測定OD值結果見表5。

從表5可以看出，隨著接種量的增多，OD值也逐漸變大。當接種量為0.5%時OD值平均值為0.583，接種量為2.0%時OD值平均值為1.430，明顯高于0.5%的接種量，所以本次試驗采用了2.0%的接種量。

表5 不同接種量乳糖乳桿菌菌液的OD值

李劍芳等[21]通過正交設計試驗確定乳酸菌最優接種量為1.0%。邵亞東等[22]為制備高濃度乳酸菌發酵劑，按1.0%接種量接種乳酸菌，可以使乳酸菌活菌數的對數值達到108～109cfu/mL以上。趙玲艷等[23]從辣椒中提取的乳酸菌用于辣椒發酵時的最佳接種量為1.0%。

2.5 最適培養基成分的確定

從表6試驗數據可知，在乳糖乳桿菌生長最佳條件（溫度35℃，時間48 h，接種量為2.0%）下，組合A2B1C2D3（蛋白胨8 g，酵母提取物3 g，牛肉膏8 g，葡萄糖20 g）測出的OD值最大，即1.614。但經過分析結果，乳糖乳桿菌實際最佳的培養基組合應為A2B4C2D1（蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g）。因該組合不在實際操作組合中，所以進行了1次驗證試驗。結果表明，A2B4C2D1組OD值為1.638，大于A2B1C2D3組合OD值，即乳糖乳桿菌最適合生長培養基成分為蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g。影響生長因子次序為酵母提取物＞葡萄糖＞蛋白胨＞牛肉膏。

表6 乳糖乳桿菌培養基成分正交試驗結果

2.6 乳糖乳桿菌生長曲線

在上述最優培養條件下，乳糖乳桿菌生長情況見表7和圖2。由表7和圖2可知，優化培養后OD值能達到1.638，活菌數為1.88×109cfu/mL。

表7 不同時間乳糖乳桿菌培養液OD值和活菌數

圖2 乳糖乳桿菌生長曲線

3 結論

（1）飼用乳糖乳桿菌屬于厭氧菌，其最佳培養條件為：培養溫度為35℃，培養時間為48 h，接種量為2.0%，初始pH為9.0。

（2）最佳培養基成分為：蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2.15 g，Tween 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.05 g，K2HPO42 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

（3）在最優培養條件下，48 h時乳糖乳桿菌OD值能達到1.638，活菌數1.88×109cfu/mL。

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（編輯：郭玉翠）

TS252

A

1002-1957(2016)05-0017-04

2016-08-09

馬燕（1984-），女，海南海口人，助理畜牧師，主要從事畜牧生產相關方面的試驗與科研工作研究.E-mail:435526209@qq.com

金樁（1967-），研究員，博士后，研究方向為動物營養與飼料加工.E-mail:414726948@qq.com