放流三疣梭子蟹遺傳多樣性和貢獻率初步研究

劉海映，呂海波，崔 帆，謝婉琳,李寶寶,王連順，劉 奇，陳 雷，邢 坤，王溪洪，史 航，宋 斌

( 1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋牧場工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點試驗室，遼寧 大連 116023；3. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023； 4.遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧 大連 116015 )

放流三疣梭子蟹遺傳多樣性和貢獻率初步研究

劉海映1,2，呂海波1,2，崔 帆1,2，謝婉琳1，2,李寶寶1,2,王連順3，劉 奇1,2，陳 雷1,2，邢 坤1,2，王溪洪4，史 航4，宋 斌4

( 1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋牧場工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點試驗室，遼寧 大連 116023；3. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023； 4.遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧 大連 116015 )

近年來我國沿海三疣梭子蟹自然資源明顯下降,為恢復(fù)現(xiàn)有資源，遼寧省自2012年開始，連續(xù)實施了4年大規(guī)模人工放流工作。在目前的增殖放流中，為檢測參與繁殖的三疣梭子蟹親本和即將放流的子代間的遺傳差異以及親本對其子代的繁殖貢獻率水平，利用10對具有豐富遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，分別對9只三疣梭子蟹雌性親本和179只即將放流的子代進行了遺傳多樣性分析及親子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子代的平均觀測雜合度、平均期望雜合度和平均多態(tài)性信息含量數(shù)值均低于參與繁殖的雌性親本，親本和放流子代之間在觀測雜合度、多態(tài)性信息含量參數(shù)方面并無顯著差異(P>0.05),但期望雜合度遺傳參數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，子代的遺傳多樣性較雌性親本呈下降的趨勢。使用4個微衛(wèi)星分子標(biāo)記時，累積排除率≥0.998，親子鑒定的準(zhǔn)確率為56.98%；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為6個時，累積排除率≥0.9999,準(zhǔn)確率達到97.21%；當(dāng)使用8個微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定時，準(zhǔn)確率達100%。同時發(fā)現(xiàn)，9只雌性親本對子代均有貢獻，最高為29.61%，最低為3.35%，不同親本之間的貢獻率存在顯著差異(P<0.05)。研究表明，微衛(wèi)星可以作為有效的標(biāo)記手段用于三疣梭子蟹增殖放流遺傳評估中。上述試驗結(jié)果將為我國三疣梭子蟹增殖放流的科學(xué)發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

三疣梭子蟹；微衛(wèi)星分子標(biāo)記；遺傳多樣性；親子鑒定；貢獻率

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)廣泛分布于我國沿海及日本、朝鮮、馬來西亞等水域[1]。具有肉質(zhì)好、食物鏈短、生長快等特點，常被用作沿岸增殖放流的目標(biāo)種，在東北亞各國增殖放流中占有重要地位[2-3]。

自20世紀(jì)60年代開始，日本率先開展了三疣梭子蟹的增殖放流工作[4]。在我國，遼寧省營口市于1986—1988年首次放流稚蟹(C2期)共60余萬只[5]。近幾十年，隨著環(huán)境惡化、過度捕撈等影響，我國近海三疣梭子蟹自然資源明顯下降。1996年的產(chǎn)量尚可維持在59 000 t，而2001年則降至11 000 t[6]。面對日益增長的水產(chǎn)品需求和捕撈壓力，單純依靠自然種群重建已不能修復(fù)受損的漁業(yè)資源。遼寧省自2012年開始，連續(xù)4年實施了三疣梭子蟹大規(guī)模增殖放流工作，共放流稚蟹(C2期)約1.4億只，其中2015年放流量超過1000萬只，增殖放流活動產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟效益[2]。然而若放流大量遺傳多樣性較低的人工苗進入自然海域，很可能降低自然海域種群的遺傳多樣性水平；改變整體的遺傳結(jié)構(gòu)，例如發(fā)生基因替換及遺傳漂變等，最終給該物種的生長、繁殖帶來深刻的影響[7]。因此，對繁殖親本和放流子代進行遺傳評估顯得非常必要。放流群體的遺傳多樣性主要由其親本情況決定，三疣梭子蟹具有很高的產(chǎn)卵能力，最終抱卵量可達1.3×105～22×105粒[8]，即少量的親本可繁殖出大量的子代。在人工環(huán)境下，自然選擇壓力被削弱，人工苗成活率高，放流后易造成群體中的遺傳瓶頸效應(yīng)[9]。在三疣梭子蟹的增殖放流中，常存在使用數(shù)量較少的雌蟹作為繁殖親本的情況，非常有必要監(jiān)測放流群體間的遺傳多樣與親本對子代的貢獻率，為今后評估放流是否對自然群體的遺傳多樣性造成影響奠定基礎(chǔ)。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記為共顯性遺傳，具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遵循孟德爾遺傳規(guī)律等特點[10]，近年來已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物，如魚類、甲殼類和貝類的遺傳育種方面[11-12]。同時，微衛(wèi)星分子標(biāo)記也可用于放流工作中，是遺傳評估、親子鑒定、貢獻率分析的有力工具[12-16]。Sekino等[13]利用4個微衛(wèi)星分子標(biāo)記對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)進行親子鑒定，發(fā)現(xiàn)親本間貢獻率差異很大。陳睿毅等[14-15]也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。王洪霞等[16]亦分析了甲殼動物不同親本對子代貢獻率的差異。在對三疣梭子蟹的研究中，多數(shù)報道主要集中于遺傳育種和譜系認(rèn)證方面[17-25],而分子標(biāo)記在增殖放流中的應(yīng)用鮮有報道。

本試驗利用10對微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對增殖放流中參與繁殖的親本和即將放流的子代群體間，進行遺傳多樣性分析，同時評估親本對子代的繁殖貢獻率，以期為將來建立完善的放流遺傳評估機制，構(gòu)建負(fù)責(zé)任的增殖放流新模式提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

繁殖親蟹為2014年遼寧省三疣梭子蟹增殖放流承擔(dān)企業(yè)所使用的海捕雌蟹。在親蟹暫養(yǎng)期間，每日投喂鮮活貝類并控制水溫，促熟產(chǎn)卵。當(dāng)抱卵雌蟹的卵色呈茶褐色后，隨機挑選即將排卵的親蟹共9只放置于同一個水池內(nèi)，編號為Fe1～Fe9，待翌日產(chǎn)卵后，取出親蟹，并對子蟹進行培育。在子蟹中間育成期間，根據(jù)其生長程度投喂藻粉、酵母、輪蟲和鹵蟲(Artemia)等不同餌料。幼體培育時，注意足量投餌，避免發(fā)生自殘、疾病，影響成活率。到稚蟹 2 期后，于放流前一天，在育成池的不同位置，隨機取子蟹179只。

1.2 基因組DNA的提取

1.3 微衛(wèi)星引物

微衛(wèi)星引物序列參考劉磊等[19-20]和李曉萍等試驗方案。所有引物5′端加FAM熒光修飾，由上海生工生物公司合成。使用親本及子代DNA樣品最終篩選出10對多態(tài)性高且擴增效果好的微衛(wèi)星引物(表1)用于試驗。

表1 10個多態(tài)性微衛(wèi)星位點的特征

1.4 PCR反應(yīng)

反應(yīng)總體積為25 μL，其中包括100 ng三疣梭子蟹基因組DNA模板(50 ng/μL)，10 mmol/L 10×PCR Buffer (Mg2+free)，0.2 mmol/L dNTP(10 mmol/L each)，2.0 mmol/L MgCl2(25 mmol/L)，雙向引物各0.8 μmol/L，1.0 U Tap DNA聚合酶(5 U/μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，退火(退火溫度見表1)1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min，4 ℃下避光保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，經(jīng)上海桑尼生物科技公司進行微衛(wèi)星分型分析。

1.5 毛細(xì)管電泳檢測

反應(yīng)體系為10 μL，包括 PCR產(chǎn)物1 μL，分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL。95 ℃變性3 min，然后利用ABI3730XL基因分析儀(Applied Biosystems，USA)的片段分析功能進行毛細(xì)管電泳，使用GeneMapper軟件收集數(shù)據(jù)，并進行人工校正。

1.6 遺傳參數(shù)分析

遺傳多樣性分析方面使用POPGENE32和CERVUS 3.0軟件分析親代和子代群體中等位基因的數(shù)目(NA)，有效等位基因數(shù)目(NE)，觀測雜合度(Ho)，期望雜合度(He)，多態(tài)性信息含量(PIC)，哈迪溫伯格平衡檢驗(HW)等參數(shù)。哈迪溫伯格平衡的顯著性標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)Bonferroni多重檢驗校正。親本與子代間的遺傳指標(biāo)差異經(jīng)SPSS22.0中的Wilcoxon signed-rank test檢驗，P<0.05認(rèn)為差異顯著，各親本間的繁殖貢獻率差異經(jīng)SPSS 22.0中的Nonparametric chi-square test檢驗，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

親子鑒定方面：通過CERVUS 3.0軟件中的模擬功能估算親子鑒定所需要的位點數(shù)及其鑒定效率。模擬參數(shù)配置如下：模擬子代數(shù)目為10000，親本檢測率為100%，位點檢測率為100%，分型誤差1%，置信水平設(shè)置為95%。經(jīng)CERVUS 3.0軟件中親子鑒定功能計算每個分子標(biāo)記的非親排除率(PE)和多個分子標(biāo)記的累積排除率(CPE)，根據(jù)鑒定成功的子代數(shù)量計算鑒定準(zhǔn)確率，最終計算出親本對子代的貢獻率。遺傳參數(shù)分析中所用公式推導(dǎo)如下：

觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量的計算公式：

例1：“分鐘合計降水量(60個分鐘值求和)與小時正點降水量0不一致”。實際工作中發(fā)現(xiàn)，該疑誤出現(xiàn)的原因多為分鐘雨量出現(xiàn)缺測現(xiàn)象，值班員在“臺站未處理”項對疑誤信息進行正確值“0”的反饋，然后進入“數(shù)據(jù)查詢與質(zhì)疑”，選好站點后，在觀測類型選擇“分鐘”，觀測要素選擇“降水量”，查詢到缺測的分鐘數(shù)，將“-”改為“0”即可。

式中，n為等位基因數(shù)目，i為等位點數(shù)，Pi、Pj為等位基因頻率。

非親排除率(PE)：子代的非親生父母本能夠被遺傳標(biāo)記系統(tǒng)排除的概率，計算方法為：

式中，Pi為微衛(wèi)星分子標(biāo)記第i個等位基因的基因頻率。

累積排除率(CPE)：所用若干遺傳標(biāo)記排除子代非親父母的概率。

⑤CPE=1-(1-PE1)(1-PE2)…(1-PEk)

式中，PEk是第k個微衛(wèi)星位點的排除率。

根據(jù)位點的多態(tài)信息含量值由高至低，逐一增加微衛(wèi)星位點(4～10)來計算位點累積非親排除率，利用軟件進行親子關(guān)系分析。在確定親緣關(guān)系后, 統(tǒng)計所有遺傳標(biāo)記下的親子鑒定準(zhǔn)確的比率，計算方法為：

⑥P=A/B×100%

式中，A為成功鑒定出父母本的子代個體數(shù)，B為取樣子代數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

10個微衛(wèi)星分子標(biāo)記在所分析的9只雌性親蟹群體(表2、表3)中，等位基因數(shù)為5～14，有效等位基因為2.7～11.6。 所有位點在親本中共出現(xiàn)69.9種有效等位基因，其中微衛(wèi)星位點Ptri05的有效等位基因數(shù)目最多，為11.6個；而微衛(wèi)星位點Pot09在所有親本中僅存在2.7種有效等位基因，數(shù)量最少。親蟹群體中，平均每個微衛(wèi)星位點的有效等位基因的數(shù)目約為7.0個。在子代中，等位基因數(shù)為14～21，有效等位基因為4.6～13.4。微衛(wèi)星位點Ptri05的有效等位基因數(shù)目同樣最多，為13.4個；而微衛(wèi)星位點Ptri11在子代中具有的等位基因數(shù)量最少，為4.6個。子蟹群體中，平均每個微衛(wèi)星位點的等位基因的數(shù)目約為9.5個。由于雄性親代的樣本信息缺失，親代在各位點的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)平均值均顯著低于子代(Wilcoxon signed-rank test，P<0.05)。

子代的平均觀測雜合度、平均期望雜合度和平均多態(tài)性信息含量數(shù)值均低于親本, Wilcoxon signed-rank test(SPSS)表明,親本和放流子代之間在觀測雜合度、多態(tài)性信息含量參數(shù)方面并無顯著差異(P>0.05),但期望雜合度遺傳參數(shù)存在顯著差異(P<0.05),子代群體的遺傳多樣性較親本呈下降趨勢(表4)。例如，微衛(wèi)星位點Pot09，子代的觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.514、0.477和0.455，而親代為0.778、0.752和0.668。有效等位基因數(shù)目多的位點在遺傳多樣性方面，其緩沖能力明顯強于等位基因數(shù)目偏少的位點，例如微衛(wèi)星位點Ptri05和Pot09。本試驗還發(fā)現(xiàn)，利用哈迪溫伯格平衡對子代群體中每個位點基因平衡狀態(tài)進行檢驗，子蟹群體中有6個微衛(wèi)星位點符合哈迪溫伯格平衡，剩余4個位點中Ptri02表現(xiàn)為顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05)，Ptri01、Ptri04、Ptri11表現(xiàn)為極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.01)。

表2 雌性親蟹基因型和等位基因數(shù)

表3 10個微衛(wèi)星位點遺傳統(tǒng)計指標(biāo)

注：NS表示差異不顯著(P>0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；ND表示數(shù)據(jù)量不足以進行哈迪溫伯格平衡檢驗；YLJ為鴨綠江野生蟹群體；LZW為萊州灣野生蟹群體.

表4 親本與子代的觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)性信息含量符號秩和顯著性檢驗

注：*表示差異顯著(P<0.05).

2.2 親子鑒定準(zhǔn)確率

親子鑒定結(jié)果顯示，4個微衛(wèi)星分子標(biāo)記時，累積排除率≥0.998；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為6個時，累積排除率≥0.9999；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為8個時，累積排除率≥0.99999；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為10個時，累積排除率≥0.999999。累積排除率隨著標(biāo)記數(shù)量的增加呈遞增趨勢，累積排除率越高，親子鑒定的準(zhǔn)確率也就越高。利用4個微衛(wèi)星分子標(biāo)記進行親子鑒定，親子鑒定的準(zhǔn)確率為56.98%；當(dāng)微衛(wèi)星分子標(biāo)記為5個時，則可以確定160個子代為親本的后代，親子鑒定的準(zhǔn)確率上升至89.39%。依次增至6個或7個微衛(wèi)星分子標(biāo)記時，無法確定親本的后代逐漸減少，親子鑒定準(zhǔn)確率分別為97.21%和98.88%。當(dāng)標(biāo)記數(shù)≥8個時，179只子蟹均能確定其母本，準(zhǔn)確率達100%(圖1)。同樣的，任憲云等[21]使用10個微衛(wèi)星分子標(biāo)記成功地從156只候選親本中鑒定出其子代群體，鑒定率也達到100%，與本試驗結(jié)果類似。

圖1 不同位點數(shù)的親子鑒定準(zhǔn)確率

2.3 不同親本對子代的貢獻率

所有親蟹對子代均有貢獻，但貢獻率差異顯著(χ2=97.687，df=8，P=0.00，Nonparametric chi-square test)。在179只子代中，有53只均是Fe5的后代，占29.61%；有37只來自Fe7，占20.67%。Fe4對子代的貢獻率最小，僅有6只是它的子代，只占3.35%。其他親蟹對子代的貢獻率維持在4.47%至12.29%之間(表5)。

表5 雌性親蟹對子代貢獻率

3 討 論

在增殖放流中與傳統(tǒng)的標(biāo)記方法相比較，微衛(wèi)星分子標(biāo)記不僅可以闡明增殖放流過程中，放流群體的遺傳多樣性水平及親本繁殖貢獻率，最終為評估放流群體的遺傳健康度提供重要支撐；還可以用于準(zhǔn)確區(qū)分放流群體與自然群體，進而追蹤放流群體的時空動態(tài)特征[14]。本研究首次嘗試在增殖放流過程中，對增殖放流承擔(dān)企業(yè)某一子蟹育成池中的所有親蟹和隨機抽檢的即將放流子代進行分析，旨在為評估放流群體的遺傳基礎(chǔ)、最終為評估維持放流子代遺傳多樣性所必需的有效繁殖群體數(shù)量奠定基礎(chǔ)。

3.1 微衛(wèi)星多樣性分析

已有研究發(fā)現(xiàn)，人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較自然野生群體低[27]，如果使用遺傳多樣性不高的子代大量放流，很可能會對野生群體產(chǎn)生不利影響[28]。本研究中，10對微衛(wèi)星引物在被檢測的親本和子代中，其平均等位基因數(shù)、平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態(tài)性信息含量分別達到了①9.8、0.8668、0.8863、0.8121；②18.2、0.8315、0.8101、0.7906(①為親本組；②為子代組)。所有遺傳多樣性指標(biāo)均高于李曉萍等[29]報道的鴨綠江與萊州灣的野生三疣梭子蟹群體(表3)，表現(xiàn)出放流群體較好的遺傳多態(tài)性。以衡量標(biāo)記遺傳信息含量的多態(tài)信息含量為例，Bostestin等[30]認(rèn)為多態(tài)信息含量>0.5的分子標(biāo)記具有豐富的遺傳信息，0.5>多態(tài)信息含量>0.25的遺傳標(biāo)記能提供合適的遺傳信息，多態(tài)信息含量<0.25 的標(biāo)記含有較少的遺傳信息，本試驗使用的10對微衛(wèi)星位點，其位點平均多態(tài)信息含量在親體和子代群體中均>0.5，顯示出豐富的多態(tài)性。然而，一個不可忽視的事實是，盡管親本和放流子代之間在觀測雜合度、多態(tài)性信息含量方面并無顯著差異,但期望雜合度遺傳參數(shù)卻存在顯著差異(P<0.05)。與描述微衛(wèi)星位點由親本遺傳到子代時，多態(tài)性變化的多態(tài)信息含量參數(shù)不同，因期望雜合度對樣本大小的敏感度小于觀測雜合度，期望雜合度常被用作描述種群遺傳多樣性的主要指標(biāo)[31]。故基于本試驗數(shù)據(jù)顯示，即將放流的子代群體的遺傳多樣性較親本呈下降趨勢，顯示出繁殖親本數(shù)目過少可能會造成遺傳變異水平的降低[16]。目前增殖放流中，雖然雄性繁殖親蟹的遺傳信息未知，但使用較少的雌性親蟹作為繁殖群體，極易造成生態(tài)系統(tǒng)中的自然選擇壓力變?yōu)槿藶檫x擇壓力[32],Selly等[12]使用10個微衛(wèi)星分子標(biāo)記對放流大西洋鮭(Salmosalar)的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。故大規(guī)模增殖放流三疣梭子蟹，是否會對放流海區(qū)三疣梭子蟹群體的遺傳多樣性水平造成影響尚需關(guān)注。本試驗還發(fā)現(xiàn)，在子蟹群體中，有4個微衛(wèi)星位點偏離哈迪溫伯格平衡。造成這種現(xiàn)象的可能原因，包括①繁殖親本較少、②無效等位基因的存在[17]、③所檢測的子蟹數(shù)量稍顯不足等。

3.2 親子鑒定準(zhǔn)確率分析

非親排除率作為評估親子鑒定的重要指標(biāo)，其值越大，親子鑒定的準(zhǔn)確率就越高[14]。按照人類親子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，單個位點的非親排除率≥0.5714，累積排除率達到0.9995以上是親子關(guān)系界定的標(biāo)準(zhǔn)，一般情況下，人類需要15個微衛(wèi)星分子標(biāo)記可以完成親子鑒定[33]。本研究中，使用4個標(biāo)記時，累積排除率≥0.998，三疣梭子蟹親子鑒定準(zhǔn)確率為56.98%；使用6個標(biāo)記時，累積排除率≥0.9999，親子鑒定準(zhǔn)確率達到97.21%。故理論上使用約6個微衛(wèi)星分子標(biāo)記就能對增殖放流中的三疣梭子蟹的親緣關(guān)系進行鑒定。

3.3 親本貢獻率分析

親本對子代貢獻率在一定程度上體現(xiàn)了自然選擇的作用，是繁殖生物學(xué)和進化生態(tài)學(xué)研究的熱點問題[16]。親本對子代的貢獻率不平衡可能導(dǎo)致等位基因丟失，經(jīng)過累代的繁殖，造成群體中的遺傳多樣性降低[14]。另一方面，這種不平衡性也摒棄了群體中的致死基因或不好的性狀。在海洋動物中，魚類親本貢獻率方面的研究開展較早，Sekino等[13]利用4個微衛(wèi)星分子標(biāo)記對褐牙鲆進行親子鑒定發(fā)現(xiàn)親本間貢獻率差異很大，Campton等[34-35]認(rèn)為精液的質(zhì)量及魚群中的等級制度導(dǎo)致貢獻率不平衡。目前關(guān)于蝦蟹類貢獻率的研究相對較少，王鴻霞等[16]對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的貢獻率研究發(fā)現(xiàn)，不同親本之間的貢獻率存在明顯差異，最高為54.28%，最低為8.57%。在本試驗中，9只雌蟹對后代均有貢獻，最高的為29.61%，最低為3.35%，不同親本貢獻率差異顯著(P<0.05，Nonparametric chi-square test)。故在增殖放流子代的人工培育過程中，不僅要直接評估繁殖親體的遺傳多樣性水平，親本的繁殖貢獻率水平也會影響到放流子代的遺傳結(jié)構(gòu)。

本試驗研究成果將深化對三疣梭子蟹增殖放流的認(rèn)知，為這一物種增殖放流管理提供遺傳學(xué)背景資料。

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ParentalContributionandGeneticDiversitybetweenBroodstockandOffspringsinSwimmingCrab(Portunustrituberculatus)ReleasingintoNaturalWaters

LIU Haiying1,2, Lü Haibo1,2, CUI Fan1,2, XIE Wanlin1,2，LI Baobao1,2, WANG Lianshun3, LIU Qi1,2，CHEN Lei1,2, XING Kun1,2, WANG Xihong4, SHI Hang4, SONG Bin4

( 1.Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 3. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 4. Fisheries Seedlings Authority of Liaoning Province，Dalian 116015，China )

The releasing and enhancement of swimming crab (Portunustrituberculatus) stock has been carried out since 2012 as the wild resources is decreased significantly in recent years. We used 10 microsatellite markers to estimate genetic diversity, the Probability of Exclusion (PE), paternity test accuracy, and the parental contribution of 9 female parents, based on 179 offsprings of swimming crab to consider the difference in contribution to reproduction between parents in the effectiveness of enhancement programs. It was found that there were significantly lower average heterozygosity and polymorphic information content (PIC), observed heterozygosity (Ho)in offsprings than those in the female parents, with significant difference in excepted heterozygosity (He)between broodstock and offsprings (P<0.05, Wilcoxon signed-rank test) and without significant difference in Ho and PIC(P>0.05), showing lower genetic diversity in the offsprings than in their female parents. The 4 microsatellite markers analysis revealed that the PE was ≥0.998 and accuracy was 56.98%. Using 6 microsatellite markers, however, the PE was ≥0.9999 and accuracy was 97.21%, and by using 8 microsatellite markers, the accuracy was 100%, indicating that the accuracy was increased with an increase in the number of microsatellite markers. Nine female parents were all found to be contributed in the production of offspring tested in this experiment, with the maximal contribution of 29.61% and the minimal of 3.35% (P<0.05, Nonparametric chi-square test). The findings indicate that the microsatellite markers as an effective means can be used for assessment of the genetic diversity of swimming crab in enhancement programs, and that provide scientific basic data for the scientific development of crab breeding and releasing in China.

swimming crab; microsatellite marker; genetic diversity; paternity test; contribution

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.002

S917

A

1003-1111(2016)06-0613-07

2016-04-05；

2016-05-27.

2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(2014203016)；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室基金開放課題(2014-MSENC-KF-14)；大連海洋大學(xué)博士啟動項目(2014017349).

劉海映(1957—)，男，教授；研究方向：海洋資源修復(fù).E-mail：hyliu@dlou.edu.cn.通訊作者：劉奇(1983—)，男，博士；研究方向：海洋資源修復(fù). E-mail：liuqisunson@dlou.edu.cn.