Cr6+對草魚腦和肝胰臟組織結構及其超氧化物歧化酶活性的影響

任洪濤，林 霖

( 河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003 )

Cr6+對草魚腦和肝胰臟組織結構及其超氧化物歧化酶活性的影響

任洪濤，林 霖

( 河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003 )

在水溫(20±1) ℃下，采用靜水測試法研究水體中不同質量濃度Cr6+(120.00、160.80、215.47、288.73、386.90 mg/L，重鉻酸鈉配制) 對體質量約10 g草魚腦和肝胰臟的組織結構及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，以探討重金屬的毒性積累和毒性機制。試驗結果表明，Cr6+對草魚的24、48、96 h半數致死質量濃度(LC50)分別為302.77、154.47、78.89 mg/L，由(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和96 h LC50×0.1計算出安全質量濃度分別為12.068 mg/L和7.489 mg/L。中毒初期肝細胞輕微肥大，無序離散，細胞核相對縮小，胞漿輕微展出；隨著時間的延長，肝胰臟異常的程度更加嚴重，甚至肝壞死，肝細胞明顯肥大，無序性離散程度明顯增大，細胞核明顯縮小，肝細胞胞漿展出，細胞空化；腦細胞開始出現破裂，細胞液溢出，細胞核輕微聚集；隨后腦細胞的異常程度更加嚴重，細胞破裂、細胞核聚集程度嚴重。隨著Cr6+質量濃度的升高和時間的延長，草魚肝胰臟中超氧化物歧化酶活性降低。

草魚；Cr6+；質量濃度；組織器官；超氧化物歧化酶

隨著工農業的發展，在生產過程中產生大量重金屬廢棄物，這些重金屬大部分最終流入河流、湖泊等水域，對水生生物造成嚴重污染。在水環境中重金屬離子富集于底泥中, 然后被浮游生物富集, 再通過食物鏈進入魚體內大量蓄積。重金屬在魚體中不斷蓄積，通過食物鏈進入人體后，對人體的生長發育造成了許多不良影響，甚至危及人類的生命安全，因此研究重金屬在魚體中的積累具有重要意義。鉻(Chromium，Cr)是水產動物機體必需的微量元素之一，自然界中主要以鉻鐵礦FeCr2O4(Cr3+)的形式存在，適量的Cr3+可以降低動物機體血漿中的血糖含量，提高機體胰島素的活性，促進糖和脂肪的代謝，提高機體的應激反應能力等[1]。而Cr6+則是一種強氧化劑，具有強致癌變、致畸變、致突變的作用，對生物體的傷害較大。近年來隨著工業的迅猛發展，水環境中鉻的含量不斷上升，過量的鉻離子通過魚類的口、皮膚和鰓進入魚體內，在魚體內蓄積超出一定范圍時，危害魚類的組織結構，影響其生理功能、生長發育。過量的鉻在水產動物中蓄積，終將危及人類的健康。Cr6+嚴重危害水生生物以及自然生態環境，我國將其列入中國水環境優先控制污染物黑名單。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)為我國四大家魚之一，是人工養殖的主要種類之一，每年產量居于世界前列。目前有關草魚的研究主要集中在營養價值、轉基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而針對養殖水環境重金屬污染對草魚毒性效應的研究卻較少。

養殖水環境中Cr6+的毒性主要取決于在生物體內的吸收和積累，所以，研究在一定含量和時間下，Cr6+在草魚組織中的吸收、積累的影響，有利于揭示重金屬離子的吸收、積累機制。本試驗主要研究了水體中不同含量Cr6+對草魚腦和肝胰臟組織結構及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，為研究重金屬的毒性積累和毒性機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自洛陽市水產市場，暫養3 d后進行試驗。暫養期間24 h連續充氣，每日投喂市售商品飼料1～2次，并及時清除殘餌及糞便。正式試驗前停食1 d，選取體長8.0～10.0 cm、體質量約10 g、體質健壯、規格整齊的個體進行試驗。

試驗在6 L水桶中進行。Cr6+由重鉻酸鈉(Na2Cr2O7·2H2O，分析純，上海化學試劑總廠)配制。試驗用水為曝氣24 h的自來水，水溫(20±1) ℃，pH 7.0±0.5。試驗期間連續充氣。

1.2 方法

每一水桶中加入1 L的藥液，10尾草魚，不投喂也不充氧。死亡標準為腹部朝上、失去游動能力、針刺無反應，及時撈出死亡個體。

1.2.1 預試驗

配制1000 mg/L的重鉻酸鈉母液，按試驗設置稀釋成不同質量濃度的溶液。以10倍之差估計5個質量濃度梯度。每個質量濃度組用草魚5尾，處理24 h，試驗進行2～3次，找出Cr6+對草魚的24 h最小致死質量濃度和100%致死質量濃度的范圍，記錄重金屬離子染毒時，草魚的反應，為正式試驗設計質量濃度梯度和觀察魚的活動提供依據。

1.2.2 正式試驗

根據預備試驗結果按等比級數設計5個質量濃度組：120.0、160.8、215.472、288.73、386.9 mg/L，1個空白對照組，每組3個平行，每個桶中放入草魚10尾。隨時觀察試驗魚的癥狀，撈出死亡個體，記錄24、48、96 h各組草魚死亡的尾數，統計草魚的死亡率。死亡的判定標準：魚腹部向上，鰓停止運動。用直線內插法，以質量濃度的常用對數為橫坐標， 死亡率的概率單位為縱坐標，測出24、48、96 h草魚的半致死質量濃度(LC50)；由公式SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ=96 h LC50×0.1計算出安全質量濃度(SC)。

取出死亡草魚肝胰臟和腦組織，一部分放入10%甲醛溶液中固定，用來制作組織切片；另一部分裝入1.5 mL EP管中，做標記，置于-20 ℃冰箱中保存。用南京建成生物工程研究所試劑盒測定肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性。

1.3 數據統計與分析

試驗測得的所有數據均采用Excel進行整理；用SPSS軟件中的單因素方差分析進行統計分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 草魚中毒的行為癥狀

草魚種Cr6+中毒的癥狀為：草魚進入高質量濃度組水體后，躁動不安，在水桶內快速游動，隨著染毒時間的延長，平衡游泳能力受影響，不斷在水中側翻打轉、急速游動、上下直竄，持續一段時間后，活動力下降，游動遲緩，反應遲鈍，最后喪失運動能力，躺臥水底，魚體上浮，腹部側斜向上，僅見鰓蓋微動直至死亡；最初幾小時內，低質量濃度組草魚的活動狀況與對照組無明顯差異，均在水桶內平緩游動，看不出有任何中毒現象，隨著染毒時間的延長草魚逐漸失去活力，胸鰭和腹鰭基部充血，對外界刺激反應遲鈍，出現類似于高質量濃度組的癥狀；而在染毒后期，無論高、低質量濃度組死魚數目均增加，死魚體僵硬呈灰白色，懸浮于水面。

2.2 Cr6+ 對草魚的急性毒性

Cr6+質量濃度與草魚的平均死亡率呈明顯的劑量效應和時間效應關系：相同質量濃度條件下，草魚的平均死亡率隨著時間的延長而增加；相同時間內，草魚的死亡率隨著Cr6+質量濃度的升高而增加(表1)。

表1 草魚在不同質量濃度Cr6+、不同暴露時間的死亡率 %

24、48、96 h的半致死質量濃度分別為302.77、154.47、78.89 mg/L；由SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ= 96 h LC50×0.1計算出安全質量濃度分別為12.068 mg/L和7.489 mg/L(表2)。

表2 Cr6+對草魚的急性毒性線性回歸方程、半致死質量濃度及安全質量濃度

注：y：死亡率概率；x：質量濃度對數.

2.3 Cr6+對草魚肝胰臟和腦組織結構的影響

顯微鏡下觀察組織切片發現，肝細胞出現不同程度的異常(圖1)。由圖1可見，對照組草魚肝胰臟細胞完整，細胞輪廓清晰，無異常；Cr6+處理24 h時，肝胰臟出現輕微異常，肝細胞輕微肥大，無序離散，細胞核相對縮小，胞漿也有輕微展出；Cr6+處理96 h時，肝胰臟異常程度加重，甚至肝壞死，肝細胞明顯肥大，無序離散程度明顯增大，細胞核相對縮小明顯，肝細胞胞漿展出，細胞空化。

對照組草魚腦細胞完整，可以清晰地分辨出細胞輪廓，無異常；Cr6+處理24 h時，腦細胞出現輕微異常，細胞開始破裂，細胞液溢出，細胞核輕微聚集；Cr6+處理96 h時，草魚腦細胞異常的程度加重，細胞破裂、細胞核聚集程度嚴重。

在顯微鏡下觀察石蠟切片，發現腦細胞出現不同程度的異常(圖2)。

圖2 Cr6+對草魚腦組織結構的影響

2.4 Cr6+對超氧化物歧化酶活性的影響

與對照組相比，48 h時，Cr6+質量濃度120 mg/L處理組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性下降不顯著，到96 h時下降顯著(P<0.05)；215.472 mg/L時，48、96 h時草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性下降顯著(P<0.05)。同一質量濃度下，48、96 h時120 mg/L組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)；215.472 mg/L時，48、96 h時草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)。同一時間，48 h時 120 mg/L和215.472 mg/L組草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)，96 h差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3 Cr6+作用下草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性

3 討 論

3.1 鉻對魚類的急性毒性

鉻是生物體必需的微量元素之一，微量的鉻對生物無毒害，并能促進生物生長發育[2]，但過量可影響其生長代謝，可使蛋白質變性，使核酸和核蛋白沉淀，干擾酶系統，抑制動物的生長繁殖，引起機體中毒[3]。重金屬對魚類的毒害作用主要通過兩條途徑：一是重金屬離子與魚體表及鰓分泌的黏液結合，形成蛋白質的復合物充塞于鰓瓣間隙，阻礙鰓絲的正常生理機能，引起呼吸障礙，窒息而亡；二是重金屬離子通過鰓及體表進入魚體內，與體內的關鍵酶活性中心的硫氫結合成難溶解的硫醇鹽，抑制酶的活性，妨礙機體的代謝作用，引起死亡[4]。本研究發現，草魚在Cr6+中毒時首先是引起呼吸障礙，然后引起機體魚鰭部位充血，最后衰竭死亡。本研究發現水體Cr6+對草魚種的96 h半致死質量濃度為74.89 mg/L，安全質量濃度為7.489 mg/L，遠高于我國漁業水質標準所規定的Cr6+≤0.1 mg/L的指標，說明草魚對Cr6+的耐受性相對較高。Cr6+對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)仔魚和稚魚的安全質量濃度分別為1.579、5.798 mg/L[5]；Cr6+對鯽魚(Carassiusauratus)的96 h半致死質量濃度為244.1 mg/L，安全質量濃度為24.41 mg/L[6]；Cr6+對孔雀魚(Poeciliareticulata)的96 h半致死質量濃度和安全質量濃度分別為43.40 mg/L和4.34 mg/L[7]；Cr3+對于唐魚(Tanichthysalbonubes)96 h半致死質量濃度和安全質量濃度分別為55.96 mg/L和5.596 mg/L[8]。由此可見，不同魚種對鉻的耐受性存在較明顯的種間差異，除重金屬外，環境中的理化因素如pH、溫度、水質硬度等也影響著重金屬毒性[9]。因此，綜合考慮環境污染物對魚類的毒性有著更重要的意義。

3.2 Cr6+急性中毒對魚類組織結構的影響

重金屬離子被魚體組織吸收后，隨血液循環到達各組織器官，妨礙組織細胞代謝過程而出現組織學的超微損傷。肝胰臟是魚代謝和積累重金屬離子的主要器官[10]。重金屬對肝細胞結構的破壞無疑將影響魚類的代謝功能，導致魚類死亡。解剖發現，不同質量濃度下死亡的草魚肝胰臟出現不同程度的彌散現象，在相同時間內，彌散的程度隨著水體中Cr6+的質量濃度升高而嚴重，同一質量濃度條件下，死亡草魚的肝胰臟彌散程度隨時間的延長而嚴重。組織異常的原因可能是Cr6+誘導自由基介導過程發生改變，脂質出現過氧化，破壞生物膜，改變細胞形態，細胞功能出現障礙。

機體感應外部環境的變化通過神經傳導傳遞至大腦組織，經大腦處理后，通過機體調節來適應環境變化。試驗過程中觀察到，草魚出現一系列異常行為，皆因水中含有Cr6+而對草魚的腦組織造成影響的外在表現。

3.3 Cr6+對魚類超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶是保護酶系統的重要組成部分，能維持體內活性氧產生和清除的動態平衡，防止自由基的毒害。本試驗結果表明，與對照組相比，試驗組草魚肝臟中超氧化物歧化酶的活性均降低；48 h時，高質量濃度組的超氧化物歧化酶活性低于低質量濃度組；96 h時，高質量濃度組的超氧化物歧化酶活性高于低質量濃度組；同一質量濃度下，隨著時間的延長，超氧化物歧化酶的活性降低。這與黃姑魚(Nibeaalbiflora)肝胰臟超氧化物歧化酶的活性變化大致相同[11]，也與Lee等[12]描述的生物受到外界環境脅迫時體內保護酶的變化規律相一致。Vlahogianni 等[13]研究認為，當機體抗氧化酶活性受到抑制后，清除自由基的能力下降，引起氧化損傷，因此抗氧化酶活性降低造成的活性氧傷害可能是魚類死亡的重要原因之一。水生動物抗氧化酶是一類敏感的分子生態毒理學指標，抗氧化酶可作為生物體氧化脅迫和損傷的標志物，用于監測重金屬污染物對水生動物的毒性效應[14]。

本研究中草魚肝胰臟組織中超氧化物歧化酶活性的降低程度與水體Cr6+污染水平有一定的關系，可否用Cr6+作為檢測水體污染的生物學指標，還有待進一步深入研究。

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EffectsofConcentrationsofChromiumIononHistologicalStructureofBrainandHepatopancreasandHepatopancreaticSODActivityinGrassCarp

REN Hongtao，LIN Lin

( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China )

In the experiment, the influence of different concentrations of Cr6+(120.00, 160.80, 215.47, 288.73, and 386.90 mg/L) on histological structure of brain and hepatopancreas and superoxide dismutase (SOD) activity in hepatopancreas were studied in grass carp (Ctenopharyngodonidellus) with body weight of some 10 g at water temperature of (20±1) ℃ by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metal. It was found that the LC50of Cr6+to grass carp was 302.77 mg/L in 24 h, 154.47 mg/L in 48 h, and 78.89 mg/L in 96 h, with safe concentration of 12.068 mg/L calculated by formula(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2and 7.489 mg/L estimated by formula 96 h LC50×0.1. In the early stage of Cr6+poisoning, the grass carp exposed to Cr6+had clustered hepatopancreas cells with slightly enlarged nuclei and the slightly exhibited cytoplasm. As the time elapsed, the significantly aggregated hepatopancreatic cells showed obvious hypertrophy and disorder discrete. The nucleus was relatively narrow in shape, and the cavitation. The brain cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, a slight overflow of the cytoplasm, a small number of brain cell cytoplasm overflow, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Cr6+, thus leading to hepatopancreatic cell necrosis. With the increase in Cr6+concentration and time, the activity of SOD was decreased in the hepatopanceas of grass carp.

grass carp; Cr6+; mass concentration; tissue and organ; SOD

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.007

S965.112

A

1003-1111(2016)06-0644-05

2015-12-24；

2016-03-10.

河南科技大學博士科研啟動基金資助項目(09001760)；河南科技大學科學研究基金資助項目(2014QN059).

任洪濤(1977—)，男，講師，博士；研究方向：水產動物分子生物學. E-mail:hthn2012@163.com.