白芍飲片標準湯劑質量標準研究

朱廣偉 李西文 陳士林

(中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

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專題——現代生物學技術在中藥資源研究中的應用

白芍飲片標準湯劑質量標準研究

朱廣偉 李西文 陳士林

(中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

目的：制備白芍飲片標準湯劑，并進行質量標準研究。方法：以水為溶劑，以標準化工藝制備標準湯劑，采用UPLC-DAD法測定芍藥苷含量，并進行轉移率、出膏率計算及指紋圖譜研究。結果：10批次白芍樣品制成的標準湯劑中芍藥苷含量為1.69～2.60 mg/mL，轉移率為60.47%～85.16%，平均轉移率為71.62%，標準偏差為8.74%。出膏率范圍為19.00%～26.50%，平均出膏率為21.89%，標準偏差為2.51%。指紋圖譜共有峰11個，確認5個，分別是：氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷。結論：本方法處理樣品簡單，重復性好，可用于白芍標準湯劑的制備及質量標準研究。

白芍；飲片；標準湯劑；指紋圖譜

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，主產于安徽、浙江、四川、山東等地。白芍飲片呈圓形薄片，氣微，味微寒、酸，含有芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷[1-5]等，具有養血調經，斂陰止汗，柔肝止痛[6-8]，平抑肝陽的功效，用于治療月經不調，脅痛，腹痛，四肢攣急[9-10]等癥。本研究以市售5個產地(湖南、安徽、山東、浙江、四川)10批次白芍飲片為材料，以標準化工藝制備白芍飲片標準湯劑[11]，考察含量、轉移率、出膏率范圍，及指紋圖譜研究，為規范根及根莖類飲片的煎煮工藝流程，為白芍飲片標準湯劑質量標準的制定提供基礎研究數據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀，HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動進樣，HP柱溫箱，UPLC-DAD檢測器；WRX-1S型BP110S電子分析天平；Thermo-18色譜柱(1.5 mm×210 mm，2.6 μm)。

1.2 受試藥物 芍藥苷(含量≥98%，批號130815)，購自成都普菲德生物技術有限公司。白芍購自河北省安國藥材市場，分別產自湖南(一等品至三等品)、安徽亳州(一等品至四等品)、浙江、山東、四川，經DNA條形碼技術鑒定均為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根。見表1。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇配制成含芍藥苷0.54 mg/mL的對照品溶液，至于冰箱中，4 ℃保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 白芍飲片 乙醇提取液制備精密稱取表1各批次白芍飲片5 g，按照2015版《中華人民共和國藥典》制備各樣品溶液。

表1 樣品來源

2.2.2 白芍飲片標準 湯劑的制備精密稱取表1各批次白芍飲片100 g，分別加7倍量的水，先浸泡30 min，煮沸60 min，過濾分離出煎煮液，最后再加6倍量水煎煮40 min。合并煎煮液，濃縮成500 mL溶液，即濃度為0.2 g/mL的原藥材溶液，取該濃縮液1 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，即得供試品，進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.3 色譜條件 色譜柱為Thormo-18色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm)；流動相為乙腈(B)-0.1%醋酸水溶液(A)，梯度洗脫，0～6 min，5%～15%B，6～11 min，15%～20%B，11～15 min，20%～25%B，15～21 min，25%～40%B，21～26 min，40%～50%B，26～27 min，50%～95%B，體積流量0.4 mL/min，進樣量3 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為230 nm，色譜如見圖1，圖2。

圖1 芍藥苷對照品UPLC-DAD色譜圖

圖2 白芍飲片標準湯劑UPLC-DAD色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1”中對照品溶液0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL分別加到5 mL容量瓶中，定容至刻度。按2.3色譜條件測定各成分的峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見圖3。

圖3 芍藥苷標準曲線

2.5 精密度考察 取同一批白芍供試品溶液，按照2.3色譜條件進樣，連續6次，測定并計算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD分別為0.4%，表明儀器精密度良好。見表2。

表2 精密度試驗結果

2.6 穩定性試驗 精密稱取白芍飲片適量，制備供試品溶液，按照2.3色譜條件進樣，分別于配制后0，4，8，10，12，24 h進樣，測定并計算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD分別為1.3%，表明24 h內供試品溶液穩定性良好。見表3。

表3 穩定性試驗結果

2.7 重復性實驗 精密稱取白芍飲片適量,平行制備6批次供試品溶液，按照2.3色譜條件進樣，測定并計算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD為1.4%，表明本方法重復性良好。見表4。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的供試品，分別精密加入等量藥苷對照品，按照色譜條件測定含量，計算芍藥苷的平均回收率為98.5%，RSD值為1.4%。見表5。

3 結果

3.1 轉移率及出膏率考察

3.1.1 白芍飲片及標準湯劑中芍藥苷含量測定 分別精密吸取2.2.1中各溶液1 μL進樣，按照2.3色譜條件測定峰面積，根據外標法計算白芍飲片中芍藥苷含量。見表6。

分別精密吸取2.2.2中供試品溶液各5 μL進樣，按照2.3色譜條件測定峰面積，根據外標法計算標準湯劑中芍藥苷含量，結果見表6。

表4 重復性試驗結果

表5 加樣回收率試驗結果

表6 白芍飲片及標準湯劑中芍藥苷含量

3.1.2 芍藥苷轉移率 根據3.1.1測定結果，按照轉移率計算公式計算芍藥苷轉移率，轉移率計算公式為：

轉移率(%)=W(mg)/M(mg)×100%

注：W表示湯劑中芍藥苷的量(mg)，M表示飲片中芍藥苷的量(mg)。

3.1.3 標準浸膏出膏率計算結果 精密吸取混合均勻的2.2.2供試品溶液10 mL于蒸發皿中，40 ℃真空干燥至恒重，稱量重量，根據出膏率公式計算標準湯劑出膏率。見表8。

出膏率(%)=(w×V)/(v×M)×100%

注：M表示藥材量(g)，V表示中藥飲片標準湯劑體積(mL)，v表示取樣體積(mL)，w表示取樣所得干膏量(g)。

表7 芍藥苷轉移率計算結果(±s)

表7 芍藥苷轉移率計算結果(±s)

樣品編號轉移率(%)x±sBS0177.96%BS0265.61%BS0375.29%BS0462.03%BS05BS0660.47%64.47%71.62%±8.74%BS0781.69%BS0876.51%BS0967.02%BS1085.16%

表8 標準湯劑出膏率計算結果(±s)

表8 標準湯劑出膏率計算結果(±s)

樣品編號出膏率(%)x±sBS0123.60%BS0222.50%BS0322.10%BS0419.00%BS05BS0620.00%20.00%21.89%±2.51%BS0725.00%BS0820.50%BS0919.68%BS1026.50%

3.2 白芍飲片標準湯劑UPLC-DAD指紋圖譜研究

3.2.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標定 按照“2.3”色譜條件分別將10批次白芍飲片標準湯劑供試品溶液進樣分析，準確吸取各供試品溶液5 μL，注入UPLC記錄色譜峰信息。見圖4，生成的對照指紋圖譜見圖5。其中共有峰11個，通過UPLC-ESI-MS/MS指認5個，分別是1號峰：氧化芍藥苷(Rt=4.661)；2號峰：兒茶素(Rt=5.696)；3號峰：芍藥內酯苷(Rt=6.447)；4號峰：芍藥苷(Rt=7.102)；11號峰：苯甲酰芍藥苷(Rt=18.709)。見表9。

圖4 10批白芍樣品UPLC-DAD指紋圖譜

圖5 共有峰及其化學歸屬

3.2.2 相對保留時間及相對峰面積 對照指紋圖譜中，以芍藥苷色譜峰的保留時間和峰面積為1，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表10。3.2.3 指紋圖譜相似度評價 運用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”軟件，經過數據導入，峰點校正和數據匹配，以中位數法建立對照指紋圖譜。根據峰匹配結果，以峰面積為參數，計算出待測指紋圖譜與對照圖譜的整體相似度，結果表明，相似度均大于0.9，符合指紋圖譜相似度要求。具體計算結果如下：S1：0.984；S2：0.978；S3：0.981；S4：0.984；S5：0.989；S6：0.987；S7：0.987；S8：0.988；S9：0.973；S10：0.981。

表9 主要色譜峰的歸屬

4 結果

通過對入選的10批次白芍進行含量測定，各批次的芍藥苷含量均符合藥典的要求(芍藥苷含量≥1.2%)，含量分別為：湖南一等1.48%、湖南二等1.29%、湖南三等1.22%、亳州一等2.07%、亳州二等2.01%、亳州三等1.91%、亳州四等1.59%、浙江1.34%、山東1.56%、四川1.52%。從數據看，各產地的白芍指標成分含量存在一定的差異，亳州一等質量最優，為藥典最低值1.725倍。

選定的符合藥典含量要求的白芍飲片(芍藥苷含量1.34%～2.07%)，按照標準化工藝制備成的標準湯劑指標成分含量為1.69～2.60 mg/mL，轉移率為60.47%～85.16%，平均轉移率為71.62%，標準偏差為8.74%。出膏率范圍為19.00%～26.50%，平均出膏率為21.89%，標準偏差為2.51%。

通過分析可以看出，作為原材料的飲片，其質量優劣與湯劑含量、轉移率、出膏率并無明顯的線性關系(圖6)，通過比較發現，飲片的切制方式、質地疏松度也是影響這些指標的重要因素。因此，工業生產時，既要考慮到飲片質量，還要考慮到飲片的加工方式等因素。

表10 各共有峰相對保留時間和相對峰面積

圖6 飲片含量、湯劑含量、轉移率、出膏率趨勢圖

通過對10批次白芍飲片標準湯劑的指紋圖譜研究發現，湯劑的指紋圖譜相似度較高，均達到0.9以上，共有峰總計11個，確認5個，包括氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷，5個峰的相對保留為0.66∶0.80∶0.91∶1.00∶2.63；相對峰面積為0.06∶0.01∶0.32∶1.00∶0.01。

5 討論

中藥飲片標準湯劑作為一種標準物質和標準體系，是對傳統湯劑煎煮工藝的傳承和創新，傳統湯劑在煎煮時一般沒有固定的加水量、煎煮時間、濃縮體積等，大多根據經驗操作，如《傷寒論》中有記載：“……右二味，以水三升，煮取一升五合……”；又有記載“……右六味，以水七升，煮取三升……”，傳統煎煮方法也沒有明確的時間計量，一般以加水量及濃縮體積來控制煎煮時間，如將三升水煎煮至一升五合時即可停止煎煮，以此進行時間計量，這種粗略的計算原則不利于中藥現代化，更無法保證湯劑質量標準的制定及臨床給藥劑量的均一性?，F代煎煮規范雖對不同部位、不同功效的飲片加水量、煎煮時間作了細化，如加水量“浸過藥面2～5 cm”，煎煮時間“一般藥物20～30 min；解表、清熱、芳香類15～20 min；滋補類40～60 min；二煎時間比頭煎略縮短”，但數值范圍較寬，容易受人為因素影響而產生較大誤差。

中藥飲片標準湯劑既傳承了按照藥用部位的不同，設計不同層次的加水量，如：根及根莖類飲片首煎加7倍水，二煎加6倍水。同時也根據功效的差異及飲片的特質設計不同煎煮時間，如：一般飲片，頭煎30 min，二煎20 min；對于質地堅硬、滋補類飲片，頭煎60 min，二煎40 min，從根本上解決了工藝不統一的問題，解決了以往因煎煮工藝的不同，而導致用藥劑量無法統一的現狀，為規范根及根莖類飲片的煎煮工藝流程，為白芍飲片標準湯劑質量標準的制定提供基礎研究數據。同時，中藥飲片標準湯劑對于生產配方顆粒具有重要的指導作用，對于同種飲片，由于給定了具體的操作規范，可以從根本上減少不同批次、不同廠家間產品的差異，確保質量的均一性，保障了用藥安全及臨床療效。

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(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Quality standard research on standard decoction of paeonialactiflora

Zhu Guangwei，Li Xiwen，Chen Shilin

(InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicinalSciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the preparation and quality standard of the standard decoction of paeonia lactiflora.Methods:The standard decoction of paeonia lactiflora was preparated with water by using standardization method and the content of peoniflorin was determined by UPLC-DAD.Then calculate the transfer rate,the rate of extractum and carry on the research of fingerprint.Results:The content of paeoniflo-rin in 10 batches of standard decoction of paeonia lactiflora is 1.69～2.60 mg/mL，the transfer rate is 60.47%～85.16%，the average transfer rate is 71.62% and the standard deviation is 8.74%.The rate of extractum is 19.00%～26.50%，the average yield is 21.89% and the standard deviation is 2.51%.There were 11common peaks，5 of which were identified，including oxypaeoniflorin，catechins,albiflorin，paeoniflorin and benzoylpaeoniflorin.Conclusion:The method is simple with good repeatability，and it can be used to study the preparation of the standard decoction of paeonia lacti-flora.

Paeonia lactiflora; Medicinal slices; Standard decoction; Fingerprint

中國中醫科學院綜合性大平臺項目(編號：Z2014003-05)

朱廣偉，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥效物質基礎研究、中藥藥效組分評價體系研究，E-mail：gwzhu@icmm.ac.cn

陳士林，博士研究生導師，主要從事中藥資源學研究，Tel：(010)57203877，E-mail：slchen@icmm.ac.cn

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.001