藏藥材榜嘎及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究

郭豪杰 丁 鈺 陳維武 劉海濤 邊巴次仁 李西文

(1 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700； 2 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京，100193；3 西藏奇正藏藥股份有限公司，林芝，860000)

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藏藥材榜嘎及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究

郭豪杰1,2丁 鈺1陳維武3劉海濤2邊巴次仁3李西文1

(1 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700； 2 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京，100193；3 西藏奇正藏藥股份有限公司，林芝，860000)

目的：利用DNA條形碼技術對榜嘎及其混偽品進行鑒別，為藏藥榜嘎的鑒定提供準確可靠的依據。方法：通過分析榜嘎及其混偽品ITS和ITS2序列的遺傳距離、種內種間變異并構建NJ系統發育樹，以評價ITS2和ITS序列的鑒定效率。結果：本研究中ITS2和ITS序列擴增效率相同，在blast比對和遺傳距離距離分析上，ITS序列表現出更強的鑒定能力；通過K2P距離構建NJ樹，ITS2和ITS序列在榜嘎與混偽品間的種間變異無統計學意義，但ITS序列對易混物種的鑒定效率較高。結論：ITS序列可作為鑒定榜嘎及其混偽品的有效條形碼。

藏藥榜嘎烏頭屬;ITS

藏醫藥是中國傳統醫藥的重要組成部分，具有悠久的歷史、獨特的醫療和研究價值及市場開發潛力[1]。榜嘎是藏醫習用藏藥材，為毛茛科烏頭屬植物船盔烏頭(Aconitumnaviculare)或甘青烏頭(A.tanguticum)的干燥全草，味苦，性涼，具有清熱解毒與燥濕之功效，主要用于治療熱病等[2]。船盔烏頭在我國主要分布于西藏南部3200～5000 m的山坡草地或灌木叢中，甘青烏頭分布于西藏東部、云南西北部、四川西部等地3200～4800 m的山地草坡或沼澤草地[3]。《晶珠本草》將烏頭屬分為“白、黃、紅、黑”四種，其中榜嘎屬于白烏頭。

烏頭屬藥材形態相似，榜嘎有較多混用和代用品，西藏地區用叉苞烏頭，青海用祁連烏頭，川西用刷經寺烏頭作為榜嘎使用。同時，由于地域上的差異，同名異物或同物異名的現象也是造成榜嘎混用亂用原因之一[1]。榜嘎在不同著作中曾出現多個藏語名，《蒙藥正典·美麗日飾》中記載用百合科麥冬(Ophiopogonjaponicus)作為榜嘎的來源植物[4]。傳統鑒別方法受地域差異、活性成分和親緣關系等因素影響，存在鑒定局限性。烏頭屬植物大多具有毒性，為保障臨床用藥安全，尋求一種榜嘎藥材快速準確的鑒定方法則顯得尤為迫切。

DNA條形碼技術具有通用性強、鑒定結果可靠、重復性良好等優點，被廣泛用于中藥材鑒定中[5]。ITS2是中國學者通過大量樣本的系統研究，提出的可以作為鑒定藥用植物和近緣種的通用條形碼[6]。ITS/ITS2是中國植物DNA條形碼研究組提出可作為種子植物核心條形碼的序列[7]。目前榜嘎的鑒別主要是傳統的性狀和顯微鑒別，我們在本文通過多種數據分析方法分析ITS和ITS2對榜嘎及其混為品的鑒別能力，為建立合適的榜嘎DNA條形碼技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 實驗物種包括工布烏頭(Aconitumkongboense)、鐵棒錘(A.pendulum)和甘青烏頭(A.tanguticum)、麥冬(Ophiopogonjaponicus)等。植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，中國)，2×Tag PCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司，中國)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。scientz-48高通量組織研磨儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)，2720PCR儀(Applied Biosystems?，USA)，1-14K高速離心機(SIGMA，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取藥材樣品約50 mg，用高通量組織研磨儀研磨2 min(50Hz)后，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 反應體系為2×Tag PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μM)各1.0 μL、模板DNA2.0 μL，加ddH2O補至25 μL。各條形碼的引物序列和PCR反應程序見表1。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增情況，由測序公司進行雙向測序。

表1 引物序列和PCR反應程序

表2 Genbank數據

1.2.3 數據處理 將測序峰圖用Codon Code Aligner軟件進行拼接，將每個片段兩端引物及低質量序列切除，得到所需片段并對ITS2進行注釋剪切。同時從GenBank數據庫中搜集并下載榜嘎及其混偽品ITS序列(表2)，注釋剪切后得到ITS2，結合實驗樣品序列，運用MEGA 6.0建立NJ樹，計算遺傳距離，分析榜嘎及其混偽品親緣關系；采用Perl語言統計不同序列種內種間遺傳差異；運用最近距離法(K2P nearest distance)和相似性搜索法(BLAST1)考察序列的鑒定效率[8]。

2 結果與分析

2.1 序列信息和鑒定效率 各序列數量、長度范圍、GC含量、遺傳距離、鑒定效率等信息見表3。ITS2由ITS注釋而來，所以ITS2與ITS數量相等，都為148條。ITS2的長度范圍為194～227bp，ITS的長度在605～777bp之間。平均GC含量，ITS2為62.15%，ITS為59.26%。ITS2和ITS的最小遺傳距離相同，都為0.0000；平均遺傳距離ITS較小，為0.1702，ITS2為0.2815；最大遺傳距離ITS2較大，為0.8423，ITS為0.5351。從鑒定效率看，ITS表現較好，BLAST1和Nearest distance鑒定效率都為100%，ITS2的BLAST1和Nearest distance鑒定效率都為98.04%。綜上所述，雖然ITS2最大遺傳距離比ITS大，但是ITS最小遺傳距離要小于ITS2，并且ITS的鑒定效率高于ITS2，所以從序列信息和鑒定效率方面考慮，ITS更適合作為榜嘎及其混偽品的DNA條形碼。

2.2 不同序列種內種間差異 利用perl語言統計ITS2和ITS序列的6個值：種內變異(Theta)、種內最大變異(Coalescent depth)、平均種內變異(All intra-specific distance)、種間變異(Theta prime)、種間最小變異(Minimum inter-specific distance)、平均種間變異(All inter-specific distance)(表4)。ITS2和ITS序列的種間最小變異均大于種內最大變異，ITS2的種內變異、平均種內變異、種間變異和平均種間變異與ITS相似。綜上所述，在種內種間差異方面，ITS2和ITS序列對榜嘎及其混偽品鑒定方面都有很好表現，無明顯差別。

表3 序列信息和鑒定成功率

表4 種內種間差異分析

2.3 NJ樹鑒別分析 基于K2P遺傳距離建立NJ樹，可以用來分析不同物種間的親緣關系，以達到鑒別物種的目的。如圖1所示，ITS2和ITS序列都可以將榜嘎及其混偽品分開，但ITS2序列對烏頭屬其他物種的鑒定效率相對較差。ITS序列表現出良好的鑒別能力，能夠將不同的物種分到不同的分支上，更適合作為鑒定榜嘎及其混偽品的條形碼序列。

圖1 NJ系統發育樹

3 討論

烏頭屬植物作為有毒植物及藥用植物一直倍受廣泛的關注，全屬約有350種植物，我國約有167種，其中53種可作藥用[2-3，9]。烏頭屬植物種間系統發育復雜，該屬的分子生物學研究報道較少，多集中于生物多樣性的研究，如ISSR分析、RAPD分析[10-12]，鮮有生藥學的分子鑒定研究。He等利用條形碼技術對烏頭屬的19個物種134份樣品進行鑒定研究，但其研究僅用到psbA-trnH序列，沒有對ITS/ITS2序列進行分析[13]。榜嘎，藏名榜阿嘎保，全草均可入藥，有小毒，歷代藏醫藥書均有記載，具有清熱解毒之功效，多用于各種熱病的治療，屬于多基原藏藥材，同時同屬混偽品較多，多有毒性，傳統方法鑒定困難，給臨床用藥帶來諸多隱患。

傳統藏藥植物藥缺乏系統分類基礎研究，多采用手摸、眼看、奔聞、嘴嘗、水試、火試等表觀鑒定方法。藏藥的使用也多依賴經驗和古書記載，地區差異大，如《晶珠本草》中榜嘎為烏頭屬植物，《蒙藥正典·美麗日飾》記載以百合科麥冬作為榜嘎的基原植物[3]，因此建立一種科學快速的藏藥基原物種鑒定方法迫在眉睫。DNA條形碼在物種鑒定上具有快速、有效、操作簡便、通用性強以及易于形成標準化等特點，已有廣泛的研究和應用基礎。本研究針對榜嘎及烏頭屬常見混偽品的ITS2和ITS序列進行比較分析，結果顯示，ITS2和ITS擴增效率無統計學意義。Blast1和Nearest distance 2種分析方法上，ITS序列鑒定效率優于ITS2；通過K2P遺傳距離構建NJ樹，ITS序列表現出更好的鑒定能力。綜合分析，ITS序列可以作為榜嘎及其混偽品鑒定的候選條形碼序列。本研究為藏藥材榜嘎的鑒定提供了新的分子生物學方法，可保障其臨床用藥安全。

[1]李敏，雷志強，鐘國躍.藏醫學藥用毛茛科植物藥材品種與標準的現狀分析[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26(1)：133-137.

[2]國家中醫藥管理局.中華本草[M].北京:科學出版社，1996:1709-1753.

[3]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學出版社，1996:113-326.

[4]劉治民.藏藥榜嘎、榜那的資源調查和藥用合理性評價[D].北京：北京中醫藥大學，2013.

[5]陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[J].中國中藥雜志，2013，38(2):141-148.

[6]Chen Shilin,Yao Hui,Han Jianping,et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLOS ONE，2010，5(1):1-8.

[7]Li Dezhu，Gao Lianming，Li Hongtao，et al.Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer(ITS)should be incorporated into the core barcode for seed plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108(49):19641-19646.

[8]鄭司浩，李亞康，任偉光，等.基于DNA條形碼的百合屬分子鑒定[J].藥學學報，2014，49(12):1730-1738.

[9]朱敏,肖培根.常用藏藥榜嘎的研究[J].中藥材，1989，12(10):19-21.

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[11]田孟良，田迎秋，劉帆，等.烏頭種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].四川農業大學學報，2007，25(1):63-67.

[12]周倩，高福春，馬紅梅，等.新疆特產7種烏頭類藥材的ISSR特征分析[J].新疆醫科大學學報，2014，37(12):1614-1618.

[13]He Jun，Wong Kalok，Shaw Pangchui，et al.Identification of the medicinal plants in Aconitum L.by DNA barcoding technique [J].Planta Med，2010，76(14)：1622-1628.

(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Identification of Herba Aconiti Bonga and Its Adulterants Using DNA Barcode

Guo Haojie1,2，Ding Yu1，Chen Weiwu3，Liu Haitao2，Bianba Ciren3，Li Xiwen1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China;2InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China; 3TibetCheezhengTibetanMedicineCo.,ltd.，Linzhi860000，China)

Objective:To select an effective barcode for identifying Herba Aconiti Bonga and its adulterants using DNA barcoding technology.Methods:This study compared ITS and ITS2 sequences and analyzed genetic distances，the variations of inter-and intra-species.Neighbor-joining tree was also constructed for evaluate their identification efficiencies based on the sequences from experimentaland GenBank database.Results:The results showed that ITS and ITS2 sequences had the same amplication efficiency.ITS sequence had a better performance than ITS2 on species identification efficiency using blast and nearest distance methods.The two barcodes showed no significant difference on the identification uing NJ tree to distinguish Herba Aconiti Bonga and its adultrants.However results demonstrated that ITS can also identify all species among adultrants of Herba Aconiti Bonga.Conclusion:ITS sequence can be used as the effective barcode to identifyHerba Aconiti Bonga and its adulterants.

Tibetan medicine；Herba Aconiti Bonga；Aconitum；ITS

重大新藥創制國家科技重大專項(編號：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)；國家科技支撐計劃(編號：2015BAI05B02)；國家科技計劃港澳臺合作專項(編號：2015DFM30030)

李西文，副研究員，研究方向：中藥栽培與鑒定，Tel:(010)84084107，E-mail：xwli@icmm.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.003