藥用多孔菌DNA條形碼鑒定研究

湯 歡 蘇燕燕 雷志勇 李志明 李西文

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測(cè)評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學(xué)研究院，北京，100005)

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藥用多孔菌DNA條形碼鑒定研究

湯 歡1蘇燕燕1雷志勇2李志明2李西文1

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測(cè)評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學(xué)研究院，北京，100005)

目的：篩選采用DNA條形碼技術(shù)鑒定藥用多孔菌的有效條形碼及該方法的可行性。方法：對(duì)29種藥用多孔菌的69份樣品進(jìn)行DNA提取，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增ITS序列并進(jìn)行雙向測(cè)序，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，得到ITS序列，通過(guò)BLAST比對(duì)及基于K2P遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)聚類NJ樹(shù)開(kāi)展ITS鑒定效率評(píng)價(jià)。結(jié)果：經(jīng)過(guò)優(yōu)化的DNA提取方法，可對(duì)所有樣品成功提取到足量DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并經(jīng)過(guò)序列拼接剪切后均能得到高質(zhì)量ITS序列；物種內(nèi)ITS最大遺傳距離均遠(yuǎn)小于物種種間最小遺傳距離；基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定效率達(dá)到100%；基于K2P遺傳距離構(gòu)建NJ樹(shù)，結(jié)果顯示相同物種均聚為一支。結(jié)論：DNA條形碼技術(shù)可以對(duì)多孔菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，ITS序列可作為藥用多孔菌有效候選DNA條形碼。

藥用多孔菌；DNA條形碼；真菌；ITS

多孔菌是子實(shí)體呈孔狀且質(zhì)地革質(zhì)至木質(zhì)的一類大型擔(dān)子菌，屬于寄生或腐生生物，主要生長(zhǎng)在木材上，與高等綠色植物相比，多不常見(jiàn)。多孔菌包括多種大型藥用真菌，《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有以靈芝、茯苓、豬苓、雷丸等多孔菌藥用的記載。人類認(rèn)識(shí)和利用真菌的歷史在西方已有3 500年以上，我國(guó)則超過(guò)6 000年，但真菌分類學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展卻是在近200年左右。瑞典博物學(xué)家林奈在SpeciesPlantarum[1]中，首次記載了8種多孔菌。Christiaan Hendrik Persoon[2]將多孔菌歸入裸果綱(Gymnocarpi)褶體目(Hymenothii)菇型類(Agaricoidei)中。Elias Magnus Fries[3]在Christiaan Hendrik Persoon的分類系統(tǒng)基礎(chǔ)上，采用新的分類標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了新的科屬劃分。我國(guó)的多孔菌研究起步較晚，基礎(chǔ)薄弱，胡先骕先生將其最初采集的多孔菌送往國(guó)外進(jìn)行物種鑒定[4]。鄧叔群[5]和戴芳斕[6]先后記載中國(guó)多孔菌有50個(gè)屬。卯曉嵐[7]、趙繼鼎、張小青[8-9]等對(duì)我國(guó)的靈芝科、多孔菌科真菌也做了大量深入的研究。與綠色植物以花和果實(shí)作為主要鑒定器官不同，傳統(tǒng)鑒定真菌的主要依據(jù)是菌絲和孢子的特征，需要鑒定者有多年的經(jīng)驗(yàn)積累，主觀性較強(qiáng)。同時(shí)多孔類真菌親緣關(guān)系和進(jìn)化趨向比較復(fù)雜，用傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定所需周期長(zhǎng)，鑒定方法重現(xiàn)性較差。因此，急需尋求一種客觀且快速高效的鑒定方法。

DNA條形碼技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)的束縛，鑒定快速準(zhǔn)確，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，是傳統(tǒng)生物鑒定方法的有效補(bǔ)充和重大突破[10]。真菌是數(shù)量?jī)H次于昆蟲(chóng)的第二大真核生物類群，與動(dòng)、植物相比，真菌DNA條形碼研究鮮有報(bào)道。為此，國(guó)際生命條形碼組織專門(mén)為其設(shè)立了工作組，并成立了國(guó)際真菌條形碼專業(yè)委員會(huì)以組織協(xié)調(diào)國(guó)際真菌DNA條形碼相關(guān)研究工作。DNA條形碼技術(shù)可準(zhǔn)確辨別形態(tài)分類難以區(qū)分的真菌，任何生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的真菌均可使用該技術(shù)進(jìn)行鑒定，是傳統(tǒng)鑒定方法所不能比擬的[11]。因真菌多寄生或腐生，沒(méi)有葉綠體，適用于植物葉綠體的rbcL、matK、psbA-trnH序列不適用于真菌的鑒定，Conrad L Schoch等[12]經(jīng)過(guò)大量研究，推薦使用細(xì)胞核中的ITS基因片斷作為真菌的條形碼序列。目前，該體系已廣泛應(yīng)用于各類植物及真菌的鑒定中，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的鑒定能力[13-32]。本研究運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)多種藥用多孔菌進(jìn)行鑒定研究，進(jìn)一步評(píng)估ITS作為DNA條形碼鑒定多孔類真菌的可行性，以期篩選多孔真菌通用條形碼，為實(shí)現(xiàn)多孔類真菌的快速準(zhǔn)確鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共涉及29種藥用多孔菌的69份樣品。其中，51份來(lái)自北京陳康林野生藥用真菌研究院，5份來(lái)自大興安嶺漠河縣，5份來(lái)自西藏林芝，3份來(lái)自四川康定，1份來(lái)自四川攀枝花，4份來(lái)自市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，以上樣品經(jīng)過(guò)大型真菌分類專家卯曉嵐教授鑒定，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。本研究中的69份樣品均獲得了ITS序列，其序列均已提交至GenBank。另外，從GenBank下載了這29個(gè)物種的ITS序列。樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序 樣品DNA提取：用乙醇棉擦拭真菌后刮去真菌表面，取靠近里面的組織(木耳等不適宜刮的真菌僅用乙醇棉擦拭后即可取樣)，用刀片切成細(xì)塊，稱取樣品約40 mg。用高通量組織研磨儀(Sceintz Biotech Co.，China)，在50 Hz頻率下研磨200 s，加入核分離液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol/L NaCl，2% PVP-40，0.4% β-巰基乙醇)[33]清洗2～4次(800 μL/次)至上清液無(wú)色，用移液槍小心吸去上清液，留沉淀，加裂解液后，置于56 ℃水浴過(guò)夜(水浴約8 h)，再采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取樣品總DNA。詳細(xì)操作步驟參見(jiàn)2015版中國(guó)藥典“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”及試劑盒說(shuō)明書(shū)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用樣品信息表

PCR擴(kuò)增和測(cè)序：采用ITS序列通用引物ITS5F/4R進(jìn)行擴(kuò)增，ITS序列PCR擴(kuò)增正向引物序列為ITS5F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3；反向引物序列為ITS4R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反應(yīng)體系：以25 μL為參照，2×Taq PCR Master Mix(Aidlab Biotech Co.，China)12.5 μL，正向和反向引物各1.0 μL(2.5 μmol/L)，模板DNA量為50～100 ng(約4.0 μL所提的DNA液)，再用dd H2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94°C變性5 min；再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)均為：94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s)；72°C延伸7 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR情況，對(duì)出現(xiàn)清晰目的條帶的樣品進(jìn)行純化后，采用ABI 3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Co.，USA)進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 使用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.，USA)對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)量分析和校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)，導(dǎo)出序列。運(yùn)用MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis.，USA)軟件將98條(包括實(shí)驗(yàn)的69條和下載的29條)ITS序列進(jìn)行序列分析，并基于Kimura 2-parameter model(K2P)計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，并用自舉檢驗(yàn)法Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)各分支的支持率[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增 樣品DNA提取是開(kāi)展DNA條形碼研究的首要環(huán)節(jié)。藥用多孔菌中普遍含有大量的次生代謝產(chǎn)物，采用核分離液洗滌后，可去除細(xì)胞核中大部分的多糖、多酚等物質(zhì)，提高DNA純度。將69份樣品用高通量組織研磨儀研磨后，用核分離液洗滌2～4次(800 μL/次)，至上清液無(wú)色為止，再按DNA提取試劑盒的操作步驟提取樣品DNA，均能得到高質(zhì)量的DNA，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后均能顯示單一目的條帶，擴(kuò)增效率100%。

2.2 遺傳距離分析 29種藥用多孔菌的98條ITS序列的種內(nèi)和種間遺傳距離見(jiàn)表2。由表2可知：各物種的種內(nèi)最大遺傳距離均遠(yuǎn)小于物種間最小遺傳距離，各物種在遺傳距離上差異明顯。

2.3 BLAST分析 將實(shí)驗(yàn)獲得的69條藥用多孔菌的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3：在29種藥用多孔菌中，19個(gè)物種的最大BLAST相似度為100%，10個(gè)物種的最大BLAST相似度為99%，在69條序列中，只有漆柄小孔菌的1條序列的最大BLAST相似度為98%。BLAST相似度不是100%的序列中，其最大BLAST相似度對(duì)應(yīng)的物種均為所鑒定的基原物種。

2.4 NJ樹(shù)分析 運(yùn)用K2P模型，選取實(shí)驗(yàn)獲得的69條和從GenBank下載的29條ITS序列，以鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，各物種的ITS序列均聚為一支。由此可知，運(yùn)用ITS序列能準(zhǔn)確鑒定此類藥用多孔菌，具有較強(qiáng)的鑒定能力。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的藥用多孔菌鄰接(NJ)樹(shù)

3 討論

3.1 DNA提取 藥用多孔菌的子實(shí)體中含有較多的多酚、多糖類物質(zhì)，研磨時(shí)，多酚極易氧化成醌類，使提取出的DNA液帶顏色，在純化過(guò)程中很難去除，影響后續(xù)PCR反應(yīng)。本研究通過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行優(yōu)化后能獲得高質(zhì)量DNA。具體優(yōu)化步驟如下：1)取樣：刮去樣品表皮，稱取子實(shí)體里面的組織；2)洗滌：向每管研磨好的樣品中加核分離液清洗2～4次(800 μL/次)至上清液無(wú)色，提高所提DNA的純凈度；3)水浴：加裂解液后放入56 ℃水浴鍋中水浴約8 h，使樣品細(xì)胞中的DNA充分溶出。

3.2 鑒定 藥用多孔菌形態(tài)多種多樣，在不同發(fā)育時(shí)期的形態(tài)差異較大，運(yùn)用傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)其進(jìn)行鑒定較困難。并且，適用于植物葉綠體的rbcL、matK、psbA-trnH序列不適用于葉綠體已退化的真菌。因此，本研究選用細(xì)胞核中的ITS序列作為DNA條形碼，鑒定藥用多孔菌。本研究中，從不同產(chǎn)地收集的69份樣品均可穩(wěn)定獲得其ITS序列，各樣品種內(nèi)最大遺傳距離均遠(yuǎn)小于種間最小遺傳距離，所有樣品在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中均能BLAST比對(duì)到正確的物種。同時(shí)，NJ樹(shù)結(jié)果顯示各物種的ITS序列均聚為一支。由此可知，運(yùn)用ITS序列能準(zhǔn)確鑒定此類藥用多孔菌，具有較強(qiáng)的鑒定能力。

表2 藥用多孔菌種內(nèi)及種間遺傳距離表

表3 BLAST比對(duì)結(jié)果表

3.3 結(jié)論 依據(jù)真菌的形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性以及生理生化指標(biāo)進(jìn)行分類鑒定的傳統(tǒng)方法，重復(fù)性差，由于受到許多主觀因素影響，易于發(fā)生誤判。并且，由于真菌的鑒定不同于維管植物，分類特征微小，進(jìn)化更為復(fù)雜，需要鑒定者有較豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，給真菌的傳統(tǒng)分類鑒定帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。DNA條形碼技術(shù)作為一種分子鑒定技術(shù)，不受物種外部形態(tài)的影響，對(duì)能提取出DNA的各類型樣品均能進(jìn)行鑒定。DNA條形碼技術(shù)經(jīng)過(guò)10余年的發(fā)展，已被用于中藥鑒定學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、發(fā)育進(jìn)化、生物多樣性保護(hù)等領(lǐng)域[35]。Scott E.Miller稱DNA條形碼技術(shù)推動(dòng)了分類學(xué)的“文藝復(fù)興”[36]，能夠給日漸萎縮的傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)帶來(lái)新的發(fā)展機(jī)遇。向麗等[37]使用ITS序列對(duì)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，Conrad L Schoch等推薦使用ITS基因片斷作為真菌的有效DNA條形碼序列。本研究對(duì)多種藥用真菌的條形碼鑒定研究結(jié)果表明ITS序列可作為潛在的多孔菌通用條形碼序列。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of medicinal polypore using DNA barcoding

Tang Huan1，Su Yanyan1，Lei Zhiyong2，Li Zhiming2，Li Xiwen1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，KeyLaboratoryofBeijingforIdentificationandSafetyEvaluationofChineseMedicine，Beijing100700，China; 2BeijingQianjunfangMycologicalResearchInstitute，Beijing100005，China)

Objective:To study the feasibility of applying DNA barcoding technique to identify medicinal polypore.Methods:The genomic DNAs were extracted from 69 samples，and the ITS sequences were amplified and bidirectionally sequenced.All the sequences were assembled.The genetic distances were computed by Kimura 2-parameter(K2P)model and Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree was constructed.Results:The maximum intraspecific genetic distance of each species were all less than the minimum interspecific genetic distance.The ITS sequences were identified using Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)method in the GenBank database.The ITS sequences of each species were clustered into one clade respectively using NJ tree method.Conclusion:The ITS sequence can be used as a candidate DNA barcode of medicinal polypore.

Medicinal polypore; DNA barcoding; Fungi; ITS sequence

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2015BAI05B02)；中央科研院所公益項(xiàng)目(編號(hào)：ZXKT15029，ZZ2014029)

湯歡(1986—)，男，博士研究生，研究方向：經(jīng)典植物分類及中藥材分子鑒定

李西文(1978—)，男，博士，副研究員，電話/傳真：(010)84084107，E-mail：xwli@icmm.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.005