基于ITS2條形碼鑒定水紅花子及其混偽品

任 莉 辛天怡 郭夢月 姚 輝 龐曉慧

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京，100193)

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基于ITS2條形碼鑒定水紅花子及其混偽品

任 莉 辛天怡 郭夢月 姚 輝 龐曉慧

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京，100193)

目的：利用ITS2條形碼對中藥材水紅花子及其混偽品進行鑒定研究。方法：為對該中藥材進行準確鑒定，共收集71份樣本，包含藥材正品及其混偽品。通過對樣品進行DNA提取、PCR擴增、雙向測序，利用CodonCode Aligner軟件進行序列質量評價與拼接，獲得ITS2序列。用MEGA軟件進行序列比對、變異位點及遺傳距離分析，采用最近距離法和構建NJ(鄰接)樹法來評價ITS2條形碼的鑒定能力。結果：水紅花子藥材基原物種紅蓼ITS2序列種內遺傳距離為0～0.0124，與其混偽品水蓼、酸模葉蓼以及春蓼的種間遺傳距離分別為0.0334～0.0508、0.0688～0.0875、0.0379～0.0467。紅蓼種內最大遺傳距離小于其與混偽品的種間最小遺傳距離，表明ITS2條形碼可以準確鑒定水紅花子與其混偽品。此外，基于ITS2序列構建的NJ樹也可將水紅花子及其混偽品明顯區分開。結論：ITS2條形碼是鑒別水紅花子藥材的有效工具，可為保障該藥材生產投料安全提供新的技術手段。

水紅花子；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

水紅花子為蓼科蓼屬植物紅蓼PolygonumorientaleL.的干燥成熟果實，具有散血消癥、消積止痛、利水消腫等功效[1]。現代藥理研究表明水紅花子具有抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺血等作用[2-7]，臨床上可用于治療胃癌、腸癌、肝癌、胃痛、糖尿病等[8-9]。紅蓼的全草、花序、果實和根均可入藥[10]。除具有重要藥用價值外，紅蓼還可食用，并有望被制成殺蟲劑與吸附劑[11-15]，具有重要開發價值。然而，由于其同屬物種形態特征高度相似、地方習用品廣泛存在，使其混偽現象嚴重，常見的混偽品有水蓼P.hydropiperL.、酸模葉蓼P.lapathifoliumL.以及春蓼P.persicariaL.[4]等，為其質量控制以及深入研究帶來了困難。因此，為保障水紅花子的用藥安全以及進一步研究開發的順利進行，需要一種快速、準確的方法對其進行鑒定。

DNA條形碼是利用相對較短的、標準的DNA片段來進行物種鑒定的一項新的分子鑒定技術，是近年來的研究熱點[16]。Chen等[17]比較了7個候選DNA條形碼(psbA-trnH，matK，rbcL，rpoC1，ycf5，ITS2，ITS)對藥用植物鑒定的有效性，發現ITS2序列的物種水平鑒定效率達到92.7%，首次提出以ITS2為核心，psbA-trnH為補充序列的藥用植物條形碼鑒定體系。隨后，ITS2條形碼被廣泛應用于中藥材鑒定[18-31]，并建立以ITS2為主體的中藥材鑒定體系和網絡鑒定數據庫(http://www.tcmbarcode.cn)，該鑒定體系現已納入《中華人民共和國藥典》[32]。我們利用ITS2條形碼對水紅花子藥材進行鑒定研究，擬解決該藥材的真偽鑒別問題，為保障水紅花子用藥安全提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共收集實驗材料71份。其中水紅花子樣本44份，包含藥材樣本29份，原植物樣本15份；其混偽品樣本27份，包含酸模葉蓼18份，春蓼9份。樣品采自北京、吉林、四川、上海、福建、浙江等地，憑證標本經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖研究員及通化師范學院于俊林教授鑒定，并保存于中國醫學科學院藥用植物研究所。另外，從GenBank下載ITS2序列5條，分別為酸模葉蓼1條，水蓼4條。樣本信息詳見表1。

表1 樣品信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 分別取水紅花子藥材樣本約40 mg(適當粉碎，加入樣本量10%的PVP-40)，硅膠干燥的基原植物葉片約20 mg，均用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/s)后，利用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 采用ITS2序列通用引物，正向ITS2F：5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ，反向ITS3R：5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3' 。擴增體系及程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則”[32]。PCR擴增產物委托上海美吉測序公司進行雙向測序。

1.2.3 數據處理 測序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.，USA)校對拼接，去除引物區。將所獲序列及GenBank下載序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8 S和28 S區段獲得ITS2間隔區序列[33]。將所有序列用軟件MEGA5.1分析比對[34]，并基于K2P模型進行遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構建系統聚類樹，利用bootstrap(1 000次重復)檢驗各分支的支持率。

2 結果與分析

2.1 水紅花子及其混偽品ITS2序列特征 水紅花子基原物種紅蓼44條ITS2序列的長度為245 bp，GC含量為66.9%～67.8%。紅蓼序列間存在3個變異位點，分別為73位點A-G變異，133位點C-T變異，228位點G-A變異，分為6個單倍型?；靷纹匪ぁ⑺崮Ｈ~蓼以及春蓼ITS2序列長度分別為245 bp、250 bp和245 bp，GC含量為66.1%～68.0%。紅蓼與水蓼、酸模葉蓼以及春蓼ITS2序列間存在較多的變異位點，詳見圖1。

圖1 水紅花子及其混偽品ITS2序列種間變異位點信息

表2 水紅花子種內及與其混偽品種間K2P遺傳距離

2.2 水紅花子及其混偽品種內及種間遺傳距離分析 將紅蓼的ITS2序列進行遺傳距離分析，種內最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.0124。水蓼、酸模葉蓼以及春蓼ITS2序列種內遺傳距離分別為0～0.0292、0～0.0040和0。紅蓼與水蓼，紅蓼與酸模葉蓼以及紅蓼與春蓼之間的遺傳距離分別為0.0334～0.0508、0.0668～0.0875、0.0379～0.0467。紅蓼與其混偽品種間最小遺傳距離大于紅蓼種內最大遺傳距離，說明采用ITS2序列可以將水紅花子與其混偽品準確區分開。

2.3 構建NJ樹鑒別水紅花子及其混偽品從基于ITS2序列構建的NJ樹圖(圖2)可以看出，紅蓼單獨聚為一支，支持率為87%，表現出單系性?；靷纹匪?、酸模葉蓼及春蓼各自聚為一支，明顯與紅蓼分開。因此，ITS2條形碼可準確鑒別水紅花子藥材及其混偽品。

圖2 基于ITS2序列構建的水紅花子及其混偽品NJ樹

3 討論

3.1 水紅花子藥材樣本亦可成功獲得ITS2序列 DNA條形碼技術有望實現對物種進行快速、準確、自動的識別和鑒定，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應用前景，因此一經提出便受到了廣泛關注。然而，由于加工、炮制、貯藏時間長等因素，常常導致中藥材DNA降解嚴重，是否能成功獲得條形碼序列是很多專家關注的問題。研究表明許多中藥材可成功獲得條形碼序列，如木香類藥材[18]、黨參[19]、柴胡[20]、羌活[21]、大青葉[22]、人參[23]、合歡花[24]、合歡皮[24]、五加皮[25]、紅景天[26]、枸杞子[27]、秦艽[28]等。本研究中在提取水紅花子藥材樣本的DNA時，增加了取樣量(40 mg)，是葉片樣本用量的兩倍，并且在研磨前加入樣本量10%的PVP-40，結果PCR產物電泳后條帶單一明亮，所有樣本均可成功獲得ITS2序列。據報道一些藥材樣品DNA降解特別嚴重，提取到的DNA經電泳后條帶呈彌散狀態，甚至有少數是不可見的，但PCR產物電泳后可顯示出條帶，并能成功測序[20-21,24]。就其原因，主要是ITS2序列較短，且在基因組內為多拷貝，降低了擴增和測序的難度，有利于鑒定DNA降解的藥材樣品,對于中藥材DNA鑒定具有重要實踐意義。

3.2 ITS2條形碼是準確鑒定水紅花子藥材的好工具 鑒于ITS2序列具有較強的鑒定能力，Chen等提出將其作為藥用植物鑒定的標準條形碼[17]，并將其推廣應用于中藥材鑒定研究中。羅焜等運用ITS2條形碼對藥材秦艽進行了鑒定研究，結果顯示ITS2序列可有效鑒定秦艽藥材及其混偽品[28]。辛天怡等研究了ITS/ITS2條形碼對羌活藥材鑒定的穩定性與準確性，結果表明ITS/ITS2序列可穩定、準確地鑒別羌活藥材[21]。趙莎等應用ITS2序列對中藥材五加皮及其混偽品進行鑒定研究，發現ITS2條形碼可準確鑒別五加皮及其混偽品[25]。本研究應用ITS2條形碼對水紅花子進行鑒定研究。為確保研究的準確性和可重復性，收集了大量樣本(共71份)，其中水紅花子正品樣本44份，包含藥材樣本29份。通過對水紅花子基原植物紅蓼44條ITS2序列進行種內變異分析，發現紅蓼ITS2序列種內遺傳距離較小。種間變異分析表明紅蓼與其混偽品ITS2序列間的遺傳距離較大。紅蓼與其混偽品種間最小遺傳距離大于紅蓼種內最大遺傳距離。另外，從基于ITS2序列構建的NJ樹可看出紅蓼單獨聚為一支，明顯與其混偽品分開。因此，本研究顯示ITS2條形碼能夠穩定、準確地鑒別水紅花子藥材及其混偽品，是鑒定水紅花子的好工具。

3.3 運用DNA條形碼技術鑒定中藥材具有重要實踐價值 近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發展，促進了DNA分子標記鑒定技術的誕生，目前已在中藥鑒定領域中廣泛應用，推動著中藥鑒定技術不斷進步和完善。DNA條形碼是目前國際上物種鑒定的最新技術，與其他分子鑒定方法相比具有如下優勢：鑒定結果可重復性良好；方法通用性強；可構建統一數據庫和鑒定平臺，易于推廣和標準化[35]。目前該技術已在中藥材鑒定領域廣泛應用，大大加快了中藥鑒定標準化的進程。水紅花子為我國傳統中藥，據報道其同屬植物酸模葉蓼、春蓼、水蓼等在不同地區被作為水紅花子入藥，嚴重影響其藥材品質及療效[4]。由于水紅花子的混偽品來自同屬近緣植物，藥材形態近似，采用傳統的鑒定方法通常會較為困難，只有具備豐富鑒別經驗的專業人員才能準確地識別出混偽品，因此建立有效的水紅花子鑒定方法十分必要。本研究采用ITS2條形碼對其進行鑒定，可以準確便捷地鑒別水紅花子與其混偽品，為水紅花子藥材的準確客觀鑒定提供了新的技術手段。DNA條形碼技術不僅可解決中藥材的鑒定問題，而且非專業分類人員通過DNA條形碼鑒定體系也可準確鑒定藥材的正品及混偽品。鑒于DNA條形碼技術的諸多優勢，必將在今后的中藥材鑒定、流通管理以及藥材市場監管等領域發揮更大的作用。

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(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Identification of Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants using ITS2 barcode

Ren Li，Xin Tianyi，Guo Mengyue，Yao Hui，Pang Xiaohui

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective:The ITS2 barcode was used to identify Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants in this study.Methods:For the accuracy of the identification，a total of 71 samples from Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants were collected.The DNA was extracted from the samples and the ITS2 regions were amplified and sequenced.The sequences were then assessed and assembled using the CodonCode Aligner.The genetic distances and variable sites of ITS2 region were analyzed using MEGA after sequence alignment.Nearest distance and phylogenetic tree(NJ-tree)methods were used to test the identification efficiency of the ITS2 barcode.Results:The intraspecific genetic distances of Polygonum orientale were 0～0.0124，while the interspecific genetic distances between P.orientale and its adulterants were 0.0334～0.0508，0.0688～0.0875 and 0.0379～0.0467，respectively.The maximum intraspecific genetic distance of P.orientale was lower than the minimum interspecific genetic distance between P.orientale and its adulterants，which showed that ITS2 barcode could discriminate P.orientale and its adulterants accurately.Besides，the NJ tree based on ITS2 sequences supported that P.orientale and its adulterants can be easily differentiated.Conclusion:The ITS2 barcode is an effective tool for the identification of P.orientale and its adulterants.Our study may provide a new technique to ensure the production feeding security of traditional Chinese medicine.

Polygoni Orientalis Fructus; DNA barcoding; ITS2; Molecular identification

重大新藥創制國家科技重大專項“中藥新藥安全性檢測技術與標準研究”(編號：2014ZX09304307001);國家科技支撐計劃(編號：2011BAI07B08)

任莉，在讀碩士研究生，E-mail:renliwangyi@163.com

龐曉慧，博士，副研究員，主要研究方向：中藥分子鑒定研究，Tel:(010)57833051，E-mail：xhpang@implad.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.007