蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠CGRP、ET-1的影響

李朝霞 歐陽俊搖 王雅麗 趙 暉 沈 素 王麗麗 李 任

(1 首都醫科大學中醫藥學院,中醫絡病研究北京市重點實驗室,北京，100069; 2 首都醫科大學附屬北京友誼醫院,北京，100050)

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實驗研究

蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠CGRP、ET-1的影響

李朝霞1歐陽俊搖1王雅麗1趙 暉1沈 素2王麗麗2李 任2

(1 首都醫科大學中醫藥學院,中醫絡病研究北京市重點實驗室,北京，100069; 2 首都醫科大學附屬北京友誼醫院,北京，100050)

目的:探討蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿降鈣素基因相關肽(CGRP)、內皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響。方法:SD大鼠84只,雌雄各半,隨機分為對照組、模型組、蛭丹化瘀組方3個劑量(33、16.5、8.25 g/kg)。大鼠氣管內滴注LPS復制急性肺損傷大鼠模型,稱重法檢測大鼠肺含水量,放免法檢測各組大鼠血漿ET、CGRP、TNF-α的變化。結果:模型組大鼠肺含水量較正常組明顯升高(P<0.01),蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg)(P<0.01、P<0.05)以及陽性藥地塞米松(P<0.01)可降低內毒素誘導肺損傷大鼠的肺含水量;與正常組比較,模型組大鼠血漿中內皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.01);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量;與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可明顯降低大鼠血漿TNF-α含量(P<0.01)。結論:蛭丹化瘀組方方通過升高內毒素誘導肺損傷大鼠CGRP的含量,降低ET-1及TNF-α含量發揮對肺損傷大鼠的保護作用。

蛭丹化瘀組方;肺損傷;降鈣素基因相關肽;內皮素-1

急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)是嚴重感染、創傷、休克等打擊后,出現肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,造成彌散性肺間質及肺泡水腫而導致的急性低氧性呼吸功能不全癥[1]。ALI時各種肺內外因素可引起多種炎性反應遞質的釋放,引發肺內過度、失控的炎性反應,形成惡性循環,加重機體損傷[2]。蛭丹化瘀組方由制水蛭、牡丹皮、當歸、赤芍、雞血藤、黃芪、川芎組成,具有益氣活血的功效,臨床上多用于治療治療小兒支原體感染及病毒性肺炎[3-4]。本實驗采用內毒素誘導ALI的方法,觀察蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠肺含水量的影響,并通過檢測血漿降鈣素基因相關肽(CGRP)、內皮素-1(ET-1)腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化,研究蛭丹化瘀組方方對ALI大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠,SPF級,雌雄各半,體質重80～100 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 蛭丹化瘀組方由黃芪、當歸、赤芍、川芎、雞血藤、水蛭、牡丹皮組成,經水提醇沉工藝制成組方顆粒劑的流浸膏，生藥含量為4.85 g/mL,由北京中醫藥大學中藥學院中藥藥劑教研室制備。醋酸地塞米松片:天津力生制藥股份有限公司產品,批號:140511。脂多糖,由Sigma公司提供,貨號L2880。大鼠ET-1、CGRP、TNF-α放免檢測試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備、分組及給藥 參考文獻方法制備ALI大鼠模型[5]SD大鼠隨機分成6組,即對照組、模型組、蛭丹化瘀組方33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg組、陽性對照組(地塞米松0.5 mg/kg)。除對照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水外,其他各組均灌胃給與相應藥物,1次/d,連續給藥4 d。第5次給藥后1 h,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉,仰臥位固定,沿頸部正中線切開皮膚,暴露氣管,脂多糖(LPS)按7.5 mg/kg劑量,0.2 mL/100 g給藥容積于氣管內緩慢滴入,縫合創口。造模19 h后,大鼠麻醉,取材。

1.3.2 血漿TNF-α、ET、CGRP檢測腹主動脈取血,制備血漿-80 ℃凍存備用;放免法檢測血漿TNF-α、ET、CGRP,由北京華英生物技術研究所檢測。

1.4 統計學方法 運用SPSS 10.0進行單因素方差分析,LSD檢驗比較2組間差異。

2 結果

2.1 蛭丹化瘀組方對內毒素致肺損傷大鼠肺含水量的影響 結果見表1。與正常組比較,模型組大鼠肺含水量明顯升高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33、16.5 g/kg)組可明顯降低大鼠肺含水量。

表1 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠肺指數及肺含水量的影響(±s)

表1 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠肺指數及肺含水量的影響(±s)

注:與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量(g/kg)動物數肺含水量(%)對照組-1480.18±0.90**模型組-1480.99±0.78蛭丹化瘀組方組331479.65±0.55**蛭丹化瘀組方組16.51480.31±0.70*蛭丹化瘀組方組8.251480.62±0.59地塞米松組0.00051479.23±1.45**

2.2 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿內皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)的影響 與正常組比較,模型組大鼠內皮素(ET)、降鈣素基因肽(CGRP)明顯增高(P<0.01);蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)和陽性藥地塞米松可明顯降低大鼠血漿ET含量,差異較模型組明顯(P<0.05);蛭丹化瘀組方33 g/kg可明顯增加血漿CGRP含量。

表2 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

表2 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿ET、CGRP的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數劑量(g/kg)ET(pg/mL)CGRP(pg/mL)正常9-60.38±6.95**75.92±16.24**模型9-110.75±20.42103.70±16.35地塞米松組120.000578.14±29.30**97.90±18.73蛭丹化瘀組方組1133110.87±23.86130.62±13.82**蛭丹化瘀組方組1116.579.84±42.05**106.96±18.55蛭丹化瘀組方組128.2564.98±14.19**91.17±24.34

2.3 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響 與正常組比較,模型組大鼠血漿腫瘤壞死因子(TNF-α)明顯增高(P<0.01);陽性藥地塞米松及蛭丹化瘀組方(33 g/kg、16.5 g/kg、8.25 g/kg)均可降低大鼠血漿TNF-α含量,與模型組比較差異具有統計學意義。

表3 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

表3 蛭丹化瘀組方對內毒素誘導肺損傷大鼠血漿TNF-α的影響(±s)

注:與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。

組別只數劑量(g/kg)TNF-α(pg/mL)正常9-60.81±6.60**模型9-89.67±8.13地塞米松組120.000566.41±9.65**蛭丹化瘀組方組113372.74±8.09**蛭丹化瘀組方組1116.565.58±9.13**蛭丹化瘀組方組128.2562.41±7.35**

3 討論

ALl以進行性呼吸困難和難以糾正的低氧血癥為主要表現的肺部繼發性損傷[6],嚴重的ALI在臨床上也被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。由于肺微血管通透性增高,肺內液體滲出與吸收動態平衡遭到破壞,大量富含蛋白質的液體滲入組織間隙,因此肺水腫是其主要的病理表現[7]。本研究結果表明,LPS致ALI大鼠肺含水量明顯增高,經蛭丹化瘀組方33、16.5 g/kg或地塞米松治療后,大鼠肺含水量明顯降低,提示蛭丹化瘀組方可有效抑制肺損傷時肺微血管通透性增加,改善肺水腫。

內皮素(ET)是目前已知的最強的血管收縮因子,其增高可引起肺血管、支氣管痙攣和毛細血管通透性增加,并通過刺激肺部花生四烯酸合成與釋放,誘導氧自由基生成,激活致炎因子的表達,損傷肺組織[8]。研究表明,ETR拮抗劑、內皮素轉化酶抑制劑等可下調ET-1的合成和分泌,通過抑制其促炎、縮血管、抑制肺泡液體清除能力等環節,減輕肺組織炎性損傷,改善肺血流動力學、呼吸力學指標,減輕肺水腫,改善通氣換氣功能[9]。降鈣素基因相關肽(CGRP)是一種血管活性多肽,是迄今為止在人和哺乳動物內發現的一種最強的擴血管物質,其釋放受內毒素、前列腺素、緩激肽等炎性因子和遞質的調節,具有擴張血管、降低動脈血壓的作用。在病理狀態下CGRP的分秘和釋放能夠緩解缺氧所致的肺血管收縮。本實驗研究發現,模型組大鼠血漿CGRP、ET-1含量較正常組明顯升高,蛭丹化瘀組方(16.5 g/kg、8.25 g/kg)以及陽性藥地塞米松可降低ALI大鼠血漿ET-1,蛭丹化瘀組方33 g/kg還可明顯增高ALI大鼠血漿CGRP,表明蛭丹化瘀組方既可抑制ET-1生成及釋放,又可促進血漿中CGRP的合成,從而減輕肺血管、支氣管痙攣,降低毛細血管通透性,減經肺損傷。

目前認為,炎性反應是ALI/ARDS發生的主要機制[7],研究發現[11]注射LPS 6 h后,動物血清TNF-α含量就明顯升高。TNF-α作為啟動炎性反應瀑布級聯反應的促炎遞質,能誘導肺血管內皮細胞活化及中性粒細胞脫顆粒釋放氧自由基等遞質,引起白細胞遷移,損害肺泡表面活性物質系統[10]。本次研究結果顯示,蛭丹化瘀組方在減輕肺含水量的同時,可明顯降低ALI大鼠血漿TNF-α含量。

綜上,本次實驗發現蛭丹化瘀組方對LPS致ALI具有一定的改善作用,其初步的作用機制可能與其促進CGRP的合成與釋放,抑制ET-1的生成,減輕肺水腫,并通過抑制TNF-α的分泌,減輕致炎因子介導的炎性損傷。從而起到防治模型大鼠ALI的作用。

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(2016-02-29收稿 責任編輯：王明)

Effects of Zhi Dan Hua Yu prescription on CGRP and ET-1 of lung injury rats induced by LPS

Li Zhaoxia1，Ouyang Junyao1，Wang Yali1，Zhao Hui1，Shen Su2，Wang Lili2，Li Ren2

(1SchooloftraditionalChinesemedicine，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China; 2BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050,China)

Objective:To observe the effect of Zhi Dan Hua Yu prescriptionon CGRP、ET-1 and TNF-αof lung injury rats induced byendotoxin.Methods:A total of 84 SD rats withhalf males and half females were divided into control group,model group,Zhi Dan Hua Yu prescription group(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)and dexamethasone group by random,detecting the changes ofwatercontent inlung injury rats’ lung；utilizing radioimmunoassay to detecting changes of ET and CGRP in rat plasma.Results:Compared to control group，lung water content in model group rats were significantly increased(P<0.01),Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg)and dexamethasone obviously reduced water content in lunginjury rats.The endothelin(ET)and calcitonin gene peptide(CGRP)in rat plasmaof model group were significantly increased(P<0.01)compared to that of control group;dexamethasone reduced ET content(P<0.01)and Zhi Dan Hua Yu prescription(16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced ET contant apparently(P<0.01); CGRP contant in rat plasma of Zhi Dan Hua Yuprescription(33 g/kg)were increased significantly(P<0.01); The content of tumor necrosis factor-α(TNF-α)was increased apparently(P<0.01)in comparison with that of control group; dexamethasone and Zhi Dan Hua Yu prescription(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)reduced TNF-αin rat plasma obviously(P<0.01).Conclusion:Zhi Dan Hua Yu prescriptionprotect endotoxin-induced lung injury rats by increase CGRP content and reduce ET-1 and TNF-αcontent in rat plasma.

Zhi Dan Hua Yu prescription;Lung injury;CGRP;ET-1

北京市科學技術委員會“十病十藥”研發項目(編號:Z141100002214019)——“蛭丹化瘀組方用于治療小兒病毒性肺炎的成藥性研究”

沈素(1961.11—),女,本科,主任藥師,主任,研究方向:醫院藥學,E-mail:shensu11022000@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.031