豬瘟病毒流行毒株遺傳演化分析與免疫對策

吳家強(qiáng)/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

豬瘟病毒流行毒株遺傳演化分析與免疫對策

吳家強(qiáng)/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

一、豬瘟與豬瘟病毒概況

1. 豬瘟（CFS）。國際獸醫(yī)組織（OIE）規(guī)定的一類烈性傳染病之一。在臨床上，以高熱稽留，和多器官廣泛性出血為主要臨床特征。豬是唯一易感動物，不同品種不同日齡的家豬和野豬對豬瘟病毒都是高度易感，根據(jù)豬瘟的臨床特征和發(fā)病程度可將本病分為最急性、急性、慢性、溫和型四種。隨著我國C株疫苗（政府規(guī)定強(qiáng)制免疫性疾病之一）廣泛使用，典型豬瘟在臨床上較為少見，癥狀與病變不典型，在臨床上易誤診，這時需要借助實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行診斷。

未免疫豬瘟疫苗的發(fā)病豬，外觀看皮膚蒼白、貧血，皮膚下有紫色點(diǎn)狀出血斑。慢性豬瘟：耳朵皮膚出現(xiàn)壞死。大腸粘膜紐扣狀潰瘍。急性豬瘟：腸道粘膜大量出血。典型豬瘟：喉頭粘膜和扁桃體出血，脾臟邊緣出血性梗死。

豬瘟：淋巴結(jié)出血，呈大理石狀。懷孕母豬流產(chǎn)、死胎。

有些病例出現(xiàn)在規(guī)模化豬場，在臨床上，豬瘟也是造成母豬繁殖障礙的疾病之一。

2. 豬瘟病毒（CFSV）。屬于黃病毒科、瘟病毒屬，基因組是單股正鏈RNA病毒，基因組的全長是有感染性的。豬瘟病毒與牛腹瀉病毒有共同抗原。在培養(yǎng)病毒的時候，分離豬瘟病毒盡量用馬的提，不用牛的去提。用牛的去提，可能會感染BVDV病毒，在豬瘟病毒分離的時候可能會得出假陰性的結(jié)果，換成馬血清，20%，會很容易解決這個問題。

豬瘟病毒的基因組長約12.3 kb，含有1個ORF，產(chǎn)生4個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中豬瘟的E2蛋白是比較重要的免疫蛋白，可以誘導(dǎo)素產(chǎn)生綜合抗體，起到很好的免疫防疫作用。可分為3個基因型（1型，2型和3型），11個基因亞型（1.1-1.4；2.1-2.3；3.1-3.4）。

二、近年山東地區(qū)豬瘟檢測與分析

2015年，山東省地區(qū)豬場出欄頭數(shù)為4 995萬頭，位居全國第四位。

近四年，從2013～2014年，我們山東地區(qū)豬瘟的抗原檢測結(jié)果，在這四年里我們一共檢測了2 634份豬瘟一次樣品，通過PCR檢測和測序分析，其中豬瘟陽性樣品421份，豬瘟抗體的陽性率達(dá)到15.98%。

采集了沒有免疫的小豬樣品和免疫豬瘟疫苗兩周后的樣品，從時間上來說，可以規(guī)避豬瘟毒株，臨床感染率為15.98%。2014年采集了624份豬瘟一次樣品，其中豬瘟抗原陽性樣品161份，豬瘟抗原陽性率達(dá)到25.80%，這個數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出近四年的平均水平，因此我們提出假設(shè)，在此期間豬瘟病毒發(fā)生了一次大的變異，導(dǎo)致這一次的流行。在之后研究中，我們也得到了證實(shí)，2014年前后，豬瘟處于基本穩(wěn)定狀態(tài)，也是這個時間段，亞型發(fā)生了改變，從2.1 b變成2.1 d。

2013～2016年一共采集了10 002份血清樣品，其中豬瘟抗體陽性樣品6 961份，抗體陽性率達(dá)到69.60%，此數(shù)據(jù)接近合格數(shù)（國家農(nóng)業(yè)部規(guī)定豬瘟群體的抗體檢測結(jié)果陽性率達(dá)到70%為合格），2015和2016年山東的豬瘟抗體平均水平都超過了70%。根據(jù)我們的檢測，還有其他大型豬場的豬瘟抗體水平在80 %以上，一些散養(yǎng)戶和小規(guī)模豬場的抗體水平相對較低。

三、豬瘟病毒遺傳進(jìn)化分析

在樣品檢查測序的基礎(chǔ)上，近一步做了豬瘟病毒的遺傳進(jìn)化分析，在2014～2016年共分離、鑒定28株豬瘟病毒，并對其中2株進(jìn)行了全基因組測序，28株毒株的E2基因全部進(jìn)行測序。

2014年共分離到10株豬瘟病毒，其中8株是2.1 b亞型，2株是2.1 d 亞型（占總比20 %），2015年共分離到10株豬瘟病毒，其中1株是2.1 b亞型，9株是2.1 d亞型（占總比90 %），2014～2015年，發(fā)生急劇的變化。2016年上半年共分離到8株豬瘟病毒，綜合測序全部是2.1 d亞型（100%），2014年山東地區(qū)豬瘟陽性率的急劇上升，與豬瘟毒株的轉(zhuǎn)型是有很大關(guān)系的，導(dǎo)致疫苗不完全保護(hù)。我們進(jìn)一步做了豬瘟病毒的遺傳進(jìn)化的分析，從14年到16年分離出的豬瘟病毒大部分是2.1 d亞型，在2014年以前，少部分毒株是2.1 b亞型。

2014年到2015年豬瘟病毒發(fā)生了變異。

豬瘟病毒遺傳進(jìn)化小結(jié)與推測：豬瘟病毒2.1 d亞型已經(jīng)替代2.1 b亞型，成為當(dāng)前豬群新的豬瘟流行毒株。與1.1亞型的豬瘟兔化弱毒疫苗毒株相比，2.1 d亞型序列發(fā)生了很大程度的變異，其中E2蛋白的核苷酸同源性只有82%左右，氨基酸序列同源性不足90%。2.1 d亞型正朝著遠(yuǎn)離豬瘟兔化弱毒疫苗的方向進(jìn)化，那么當(dāng)前疫苗是否還能夠完全保護(hù)2.1 d亞型毒株的攻擊。

四、豬瘟病毒2.1 d亞型免疫攻毒試驗(yàn)

1.病毒-血清型中和試驗(yàn)。采用抗疫苗毒株的血清，分別中和豬瘟兔化毒株疫苗和2.1亞型毒株，在PK-15細(xì)胞上測定，中和抗體效價分別為1∶256和1∶16，差異極顯著。

2.豬瘟疫苗對2.1 d亞型的交叉保護(hù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

注：豬瘟脾淋苗購自國內(nèi)某疫苗廠家，含量為300RID/頭份；政府采購豬瘟活疫苗（脾淋源）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的效力試驗(yàn)規(guī)定，每頭份豬瘟脾淋疫苗作1;150稀釋，免疫無豬瘟中和抗體的健康仔豬，用強(qiáng)毒株攻毒，免疫仔豬全部健活（或稍有提問反應(yīng)，但無豬瘟臨床癥狀）為合格。

3. 豬瘟病毒2.1 d亞型免疫攻毒小結(jié)。疫苗免疫血清中和2.1 d亞型的能力降低，SDZP01攻毒可引起部分免疫株中和抗體延遲，持續(xù)高病毒血癥，并引起豬發(fā)病，出現(xiàn)較為典型的病變和組織病理學(xué)變化，但其致病性比1.1亞型的Shimen株弱。

五、豬瘟免疫對策

1. 豬瘟疫苗免疫遇到的問題。仔豬首免與二免時間是否必須在20/60日齡。疫苗免疫劑量是一頭份還是加倍。為什么保育豬群的豬瘟抗體水平低下。母豬免疫疫苗是跟胎免疫還是普防。疫苗有BVDV污染是否影響抗體水平。用以下兩個豬瘟疫苗使用的臨床案列來解析。

案例一：母豬存欄2 400多頭，年出欄商品豬近50 000頭。防疫豬瘟、偽狂犬病、口蹄疫（以上三病均普防，1次/3個月)、豬藍(lán)耳病（母豬使用進(jìn)口弱毒疫苗，普免4次；仔豬使用國產(chǎn)弱毒疫苗，免2次），飼料中定期添加氟苯尼考、替米考星、支原凈等藥物進(jìn)行保健。自2014年2月開始暴發(fā)疫情，仔豬陸續(xù)發(fā)燒，體溫41℃，皮膚出血點(diǎn)或出血斑，呼吸困難，部分仔豬有腹瀉和水腫癥狀，部分仔豬有神經(jīng)癥狀，死亡率50～100%。剖檢可見腎臟、心臟、脾臟、后頭、膀胱等器官點(diǎn)狀出血，淋巴結(jié)切面大理石樣出血；腸道漿膜和粘膜出血，腸系膜水腫，腹腔有膠凍樣滲出液。

豬瘟發(fā)病原因分析。豬瘟疫苗含量不準(zhǔn)確，由450RID下降為150RID。豬場免疫程序不合理。感染PRRS、PCV2等疾病，免疫功能下降。缺乏有效的免疫監(jiān)測手段。

豬場免疫程序調(diào)整與優(yōu)化。鑒于主群目前的豬瘟和藍(lán)耳病感染情況， 發(fā)病場的免疫程序調(diào)整如下：

經(jīng)產(chǎn)母豬分別于產(chǎn)后23天、配種后23天各注射一次豬瘟疫苗；仔豬超前免疫1頭份豬瘟疫苗，25日齡和65日齡再各免疫一次豬瘟單苗。嚴(yán)格把關(guān)豬瘟疫苗的質(zhì)量，采購前先讓廠家送檢豬瘟疫苗的樣品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測定抗原含量，合格后再采購?fù)慌蔚囊呙缛霂毂４妗?/p>

經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)后15日齡，分別給母豬和15日齡仔豬各注射1頭份豬瘟藍(lán)耳病疫苗。經(jīng)產(chǎn)母豬不再實(shí)施普免（原來防疫程序是4月、8月、12月各一次），仔豬第二針?biāo){耳病疫苗（35日齡），統(tǒng)一停掉。

案例二：基礎(chǔ)母豬存欄1 000頭，年出欄商品豬18 000頭，母豬跟胎防疫豬瘟脾淋疫苗（產(chǎn)后25天免疫2頭份，間隔1個月加強(qiáng)免疫2頭份）。仔豬21日齡首免1頭份，60日齡加強(qiáng)免疫1頭份。保育豬飼料中添加強(qiáng)力霉素、支原凈等藥物進(jìn)行保健。

存在的問題。仔豬和保育豬豬瘟抗體陽性率低下，而且參差不齊，三分之一的仔豬首免豬瘟疫苗后發(fā)生過敏反應(yīng)。部分仔豬發(fā)生疑似豬瘟感染，剖檢可見腎臟、肺臟、膀胱等氣管出血；淋巴結(jié)切面大理石樣出血。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為豬瘟感染。

2.豬瘟免疫的對策。仔豬的首免日零不應(yīng)該千篇一律，應(yīng)該根據(jù)各個豬場母源抗體的消長規(guī)律制定。母豬跟胎免疫的豬瘟抗體水平優(yōu)于普防。降低豬群藍(lán)耳病的帶毒量或減少藍(lán)耳病疫苗的用量和頻次，有助于提高豬群的豬瘟抗體水平。對使用的疫苗進(jìn)行定量檢測，并定期對不同豬群進(jìn)行豬瘟抗原和抗體監(jiān)測，為調(diào)整優(yōu)化豬瘟免疫程序提供參考依據(jù)。（本文根據(jù)會議錄音整理，未經(jīng)專家本人審閱，如有出入，以專家意見為準(zhǔn)。）