淺析化學檢測實驗室的方法確認和方法驗證

侯 雪， 鄭衛東, 胡 莉， 楊定清

(1.四川省農業科學院 分析測試中心，四川 成都 610066；2.中國科學院 成都有機化學研究所，四川 成都 610041；3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室(成都)，四川 成都 610066；4.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610000； 5.中國科學院 研究生院，北京 100049)

?

淺析化學檢測實驗室的方法確認和方法驗證

侯 雪1,2,3,5， 鄭衛東4, 胡 莉1,2,3， 楊定清1,2,3

(1.四川省農業科學院 分析測試中心，四川 成都 610066；2.中國科學院 成都有機化學研究所，四川 成都 610041；3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室(成都)，四川 成都 610066；4.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610000； 5.中國科學院 研究生院，北京 100049)

根據EN ISO/IEC 17025，為了證明方法是符合目的的，化學檢測實驗室應對所使用的方法進行驗證和確認。由此，可提供客觀證據證明方法的預期用途是否得以滿足。本文以方法確認和驗證的定義、范圍、要求為基礎，比較了兩者的差異；討論了何時應進行方法驗證，何時應開展方法確認，以及開展方法確認和驗證的具體程序。此外，本文還討論了方法確認和驗證過程中涉及到的性能參數，包括準確度、正確度、精密度、線性度、檢出限、定量限、選擇性/特異性和測量不確定度，為方法確認和驗證的實施提供了參考，也為實驗室依照EN ISO/IEC 17025要求，制定方法確認和驗證程序文件和作業指導書提供了指導。

方法確認； 方法驗證； 化學檢測實驗室

0 引 言

根據ISO/ IEC 17025:2005《檢測和校準實驗室能力通用要求》[1]，實驗室應使用合適的方法和程序進行檢測和/或校準，這意味著實驗室應對所采用的方法，包括標準方法和非標方法，開展適當的方法確認和驗證工作。國際上許多機構和組織，如：國際標準化組織(International Organization for Standardization, ISO)，美國分析化學家協會 (Association of Official Analytical Chemists, AOAC)，美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)，國際純粹與應用化學聯合會(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)都對“方法驗證”和“方法確認”給出了相關定義，并對其具體執行方法做出了規定。然而，在實際工作中，“方法驗證”和“方法確認”卻常常被混淆。本文從“方法驗證”和“方法確認”的定義入手，詳細詮釋了兩者的差異，以及在日常工作中，應該如何開展方法確認和方法驗證工作。

1 方法驗證和確認的定義

“方法驗證”對應于英文單詞“Verification”，ISO對其定義為“通過檢查并提供客觀證據，驗證規定要求得以滿足”[2]。通過方法驗證可證實方法適用于其預期目的的過程。確認包括研究性能特征，如：準確度、特異性、檢出限、定量限、線性度、范圍、耐用性和穩健性。“方法確認”對應于英文單詞“Validation”，根據ISO，其定義為：“通過考察和提供客觀證據，確認是否能滿足某個特定預期用途的特殊要求”[2]，即：方法確認需要“確認某個特定的分析方法能滿足分析目的。”換句話說就是“表明一個規定的方法協議，適用于某個特定類型的測試物料，以及待測物特定的濃度水平”[3]。通過方法確認可證實一個實驗室有能力重復已確認的方法，同時方法能夠達到可接受的性能水平。

從方法確認和方法驗證兩者的定義可知，如果一個實驗室希望使用某一標準方法(已通過協作研究被全面確認)，則應開展方法驗證。而某一實驗室需要研發一個新方法或使用非標方法時，則應進行方法確認。方法驗證研究范圍通常比方法確認的要小。方法驗證側重于提供客觀證據，證明該實驗室具有合理運用該方法的能力，即：在實驗室自有測試條件下，所獲得的方法性能參數能滿足要求。

2 方法驗證和確認的實施程序

2.1 方法驗證的實施程序

一般來說，進行方法驗證有以下幾種情況：①采用標準方法前；②對已確認方法進行了細微改變時(例如：使用了不同廠家的相同類型的色譜柱、改變了樣品稀釋倍數等)。

FDA實驗室手冊規定[4]：對標準方法的性能驗證可分為兩種情況：①批量分析情況下的性能驗證，②實驗室首次使用標準方法前的驗證。而前者更多意義上是屬于內部質量控制的范疇。

在方法驗證過程中，需要考慮哪些關鍵參數，取決于方法的性質和可能遇到的樣品類型。首先，應考察偏倚和精密度是否滿足定量方法的最低要求。痕量分析則需要驗證檢出限(Limit of Detection, LOD)和定量限(Limit of Quantification, LOQ)是否滿足要求。對于定性方法，必須通過方法比對，考察與現有已確認方法的相關性。理想情況下，實驗室應證明所獲得的方法性能數據滿足方法要求。如果不能滿足，則應判斷該實驗室是否可以應用此方法，產生真正符合預期目的的結果。

2.2 方法確認的實施程序

當需要確定一個方法的性能參數，是否滿足解決特定分析問題的要求時，則需要對方法進行確認，具體情況有：①研發新方法；②修改已有方法，以滿足新的分析要求；③實驗室、使用的儀器或分析員與已有方法的規定不同；④比較兩種方法是否等效，例如：新方法和標準方法[5]。

方法確認總是和一個特定的“分析系統”有關，因此，只要分析系統里的任一構件發生變化，或者當已建立的方法體系不能充分地滿足需求時，都需要對方進行“再確認”[5-7]。

方法確認的程度取決于兩個方面：①分析方法的狀態和使用經驗；②分析需求決定，即：客戶需求或法規要求。方法確認中，需要考察的性能特征至少應包括精密度、偏倚、線性度和耐用性。不需要開展深入確認研究的情況有：①將已確認的方法用于新基質；②未開展協同研究的已有方法；③提供了性能參數、通過文獻報道的方法。而需要進行深入確認的情況有：①文獻報道的方法，但未給出性能參數；②實驗室內部開發的方法[8]。

方法確認(至少)的內容至少應包括：①分析客戶對測試的特殊要求；②針對不同的需求，明確方法性能特征的定義；③考察分析方法(性能特征)是否能滿足相關要求；④對分析方法有效性的聲明[8]。化學實驗室在實際工作中，什么時候應開展方法驗證，什么時候應進行方法確認，具體該怎么做，常常難以界定。本文引用了INAB出版的《化學測試實驗室定量方法確認指南》中的相關信息(表1)，通過實例的形式，對此類工作做了解釋。

3 方法驗證和方法確認中的性能參數

3.1 準確度(Accuracy)

準確度是指測量結果與接受參考值的一致程度[9]。事實上，準確度涵蓋正確度和精密度，即：包含系統誤差(偏倚)和隨機誤差(精密度)。一個測量結果既要正確，測量的精密度也要符合要求。

表1 方法驗證和確認范圍實例*

*該表摘自《Guide to Method Validation for Quantitative Analysis in Chemical Testing Laboratories》，INAB。

3.1.1 正確度(Trueness)

正確度是指由大量測試結果得到的平均數與接受參照值間的一致程度[9]，常用偏倚來度量。在方法驗證和確認過程中，常常通過測量(有證)參考物質來獲取正確度的信息。此外，也可通過加標回收試驗，利用回收率來考察方法的正確度。回收率越低，偏倚對方法的影響越大，正確度就越低。《AOAC單一實驗室方法驗收準則(化學方法)》規定：空白樣和樣品的加標濃度應至少包括檢測區間內的3個濃度水平，對每個濃度水平需進行至少7次獨立的重復分析[10]。

考察方法正確度的第三種方式是方法比對，即通過將方法與另一已表征的參考方進行比對。具體做法為，采用兩個方法分析同一個/組樣品，比較測試結果，被測樣品可以是(有證)參考物質、內部標準物質或典型樣品。如果沒有相關規定可參考，則可以通過t-檢驗或觀察值的置信區間，評估偏倚[8]。

3.1.2 精密度(Precision)

精密度是指在規定條件下，獨立測試結果間的一致程度[9]。精密度僅依賴于隨機誤差的分布，與真值、統一真值或接受參考值無關。“獨立測量結果”意味著結果不受先前相同或相似待測物的測量結果的影響。測定精密度取決于規定的測量條件，重復性和再現性條件是測量條件的兩個極端情況，因此精密度通常可分為重現性精密度和再現性精密度，而再現性精密度又包括實驗室內再現性(中間精密度)和實驗室間再現性。精密度通常可用標準偏差和變異系數來表征。此外，也可考察重復性/再現性或重復性限/再現性限。另一種表示精密度的參數為置信區間，即：所有測量結果都以一定概率或置信水平1-α(α通常是0.05，概率為95%)分布于該區間內[12]。

表2 回收率(作為待測物濃度的函數)的期望值*

此外，還可以通過方法比對，來考察精密度，即將重復性、中間精密度和再現性的數值與現有的方法進行比較。如果沒有可比較的方法，則可以與相對重復性標準偏差和再現性標準偏差的理論Horwitz和Horrat值進行比較。

表3 精密度(作為待測物濃度的函數)的期望值*

3.2 線性度

對于一個分析程序，校準曲線的線性度反應了待測物濃度與對應信號(響應)之間的比例關系。對于儀器分析來說，推薦以下方案，以確定校準模型的有效性[13-15]：①6個或以上的校準點(包括一個空白點或一個濃度近似于零的點)；②理論上，校準點要均勻分布于目標濃度范圍內，不同濃度要單獨配制，而不能通過稀釋同一母液而制備；③校準溶液的濃度范圍應覆蓋到待測物濃度的0%～150%或50%～150%，可根據情況確定濃度范圍；④標準溶液每個濃度點至少要重復測定2次，建議3次或更多次，同時，應隨機測定。

3.3 檢出限(LOD)

通常情況下，“檢出限”的定義可分為兩種[9]：

(1) 為避免假陽性或假陰性的情況發生，在某個置信水平下(例如95%、99%或99.7%)，能檢測到的待測物的最低含量。

(2) 檢出限的定義是基于結果具有最大不確定度的期望時，為具有合理統計學不確定度的，能檢測到的最低含量。

確定檢出限的方法有多種，常見的方法有[16]：

(1) 基于目測來確定LOD。通過在空白樣中添加已知濃度的待測物，可確定能夠被可靠檢測出的最低濃度值。

(2) 基于空白標準偏差來確定LOD。可通過分析大量的空白樣(推薦20個以上)，以此計算出LOD。樣品空白樣的獨立測試次數應≥10，加入最低可接受濃度的樣品測試次數應≥10。LOD為空白樣平均值加上3倍標準偏差(+3 s)。

(3) 基于校準公式的使用范圍來確定LOD。如果無法得到LOD或與LOD相近的數據，則可利用校準方程的參數來確定LOD。例如：從校準方程：

yLOD=a+3sy/x=a+bxLOD,xLOD=3sy/x/b

獲得LOD的近似數據。

(4) 基于信噪比來確定LOD。應盡量選取濃度較低的樣品，此時，檢出限可以用3倍信噪比來表示。

3.4 定量限(LQD)

定量限是指可檢測到的、具有可接受的實驗室再現性及正確度的最低濃度[9]。定量限的傳統計算方式為空白值加上10倍的重復性標準偏差，或3倍檢出限(這兩種方式的計算結果基本一致)。如何計算定量限，實驗室應視具體情況而定。

3.5 選擇性和特異性(干擾情況)

在樣品分析過程中，常常會受到來自樣品內部或外界環境的干擾，導致測量結果發生偏離。因此，在方法確認過程中，確定所選擇的測試方法僅測量待測物是非常重要的，即：方法應不受可能導致錯誤結果產生的干擾物的影響。選擇性是指：在測試條件下，在樣品基質同時含有其他干擾組分時，方法能準確和特定地測定待測物的能力[16]。

“選擇性”和“特異性”經常被交替使用。事實上，“特異性”一般用于能對單一待測物產生獨立響應的方法，而“選擇性”則用于對可能或不能區分的一定數量的物質產生響應的方法。如果某個物質的響應能與其他物質區分，則可以說：該方法具有選擇性。由于極少有方法僅對單一待測物有響應，因此使用“選擇性”這一術語更加恰當。考察選擇性和特異性時至少應考察可能存在哪些干擾情況，具體做法有：①分析(相對)純基質或已知含量最小的天然樣本；②在簡單基質中，分析和待測參數有關的溶劑；③分析加入待測參數的基質加標樣[8]。

3.6 測量不確定度(Measurement Uncertainty, MU)

測量不確定度的定義為與測量結果相關，表征待測量的合理分布值的參數[9]。從某種意義上說，MU不只是一個方法性能參數。這是因為：方法確認是通過對一系列的方法性能特性進行評估而完成的，如：精確度、正確度、選擇性/特異性、線性度等；而MU是一個包括了所有誤差來源的綜合參數，且從方法確認和協同研究獲得的數據并不能完全滿足MU的評估。事實上，通過考察測量不確定度來進行方法確認或驗證已獲得廣泛認同。

MU是與測試結果相關的參數，用于表征合理賦予被測量值的分散性。如果需對比測量之間，以及測量與特定要求時，則應評估MU。在適用的情況下，《ISO/IEC 17025 》和《ISO 15189》均要求機構所報出的結果需附帶不確定度；因此，不確定評估是方法確認中的基本要求。

4 結 語

在實驗室檢測工作中，方法確認和方法驗證是開展檢測工作的前提條件和基本要求，應納入實驗室質量體系范疇，即制定相應的程序文件和作業指導書。目前，關于該類工作的要求規范眾多，在實際工作中，各家實驗室應根據自身的特點，分析檢測目的，客戶的要求等，確定方法確認和驗證的具體做法。本文基于定義、實施條件、具體實施過程等，詳細說明了方法驗證和確認的區別，以及方法驗證和確認過程中，需要考察的基本方法性能參數。

[1] ISO/IEC 17025, General Requirements for the competence of testing and calibration laboratories[S]. International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland, 2005.

[2] ISO 9000, Quality management systems-Fundamentals and vocabulary[S]. International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland, 2005.

[3] Thompson M., Ellison S., Wood R. IUPAC Technical Report, Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Method of Analysis [J]. Pure Appl Chem, 2002, 74(5):835.

[4] ORA-LAB.5.4.5 Methods, method verification and validation[S]. Food and Drug Administration, USA, 2001.

[5] Eurachem Guide：The fitness for purpose of analytical methods[S]. LGC, UK,1998.

[6] Huber L. Validation and Qualification in Analytical Laboratories[M]. New York, USA: Interpharm, Informa Healthcare, 1998.

[7] Wells R. J. Validation requirements for chemical methods in quantitative analysis-horses for courses[J]. Accred. Qual. Assur., 1998 (3): 189.

[8] Guide to Method Validation for Quantitative Analysis in Chemical Testing Laboratories[S]. The Irish National Accreditation Board, Dublin, Ireland, 2012.

[9] GB/T 6379.1—2004: 測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第1部分: 總則與 定 義[S]. 北京:中國標準出版社, 2004.

[10] Single Laboratory Validation Acceptance Criteria[S]. AOAC Inter., 2005.

[11] Method Validation Programs (OMA/PVM Department), including Appendix D: Guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a method of analysis[S]. AOAC Inter., 2000.

[12] Currie L. Nomenclature in evaluation of analytical methods,including quantification and detection capabilities [J]. Pure Appl Chem,1995,67(8):1699.

[13] Thompson M., Wood R. Harmonized guidelines for the use of recovery information in alaytical measurement [J]. Pure Appl Chem,1999,71(2):337.

[14] Harmonised guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical Report) [J]. Pure Appl. Chem., 2002, 74(2):835.

[15] In-house method validation-A guide for chemical laboratories, Laboratory of the Government Chemist[S]. LGC, UK, 2003.

[16] Guidelines for the validation and verification of quantitative and qualitative test methods[S]. NATA, 2012.

Method Validation and Verification in Chemical Testing Laboratory

HOUXue1,2,3,5，ZHENGWei-dong4，HULi1,2,3，YANGDing-qing1,2,3

(1. Analysis and Testing Centre, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China;2. Chengdu Institute of Organic Chemistry Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China;3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products (Chengdu), Ministry of Agriculture, Chengdu 610066, China; 4. Sichuan Institute for Food and Drug Control. Chengdu 610000,China; 5. Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

According to EN ISO/IEC 17025, methods used in chemical testing laboratories should be validated and verified, in order to prove that the selected methods are fit the purpose. Method validation and verification provides objective evidence that the particular requirements for a specific intended use of the method are fulfilled. In this study, method validation and verification is compared based on definition, scope and requirement. Meanwhile, method validation and verification procedures are specified and discussed. Moreover, the performance characteristics of a method are defined and discussed, including: accuracy, trueness, precision, linearity, LOD, LOQ, selectivity/ specificity and MU. The information provided in this study is useful in drafting and approving the program document and standard operation procedure based on EN ISO/IEC 17025.

method validation; method verification; chemical testing laboratory

2015-03-22

農業部農產品產供安全過程管控技術研究與示范(201303088-6)；農業部食用農產品環境因子風險評估項目(GJFP2014012)

侯 雪(1984-)，女，四川雅安人，在讀博士生，助理研究員。Tel.:028-84504141；E-mail:houxue127@163.com

G 482.0

A

1006-7167(2016)02-0255-04