高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量

謝紫薇，李 強，劉 姍

（1.四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610500； 2.攀枝花學院，四川 攀枝花 617000）

高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量

謝紫薇1，李 強2，劉 姍2

（1.四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610500； 2.攀枝花學院，四川 攀枝花 617000）

目的 建立同時測定芒果葉中蘆丁、槲皮素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 采用色譜柱Inertsil ODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 m)進行分析，流動相為70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脫，體積流量為1.0 mL／min，檢測波長為368 nm，柱溫為35℃。結(jié)果 蘆丁、槲皮素質(zhì)量濃度均在1.464 48～120 g／mL（R2＝0.999 8，R2＝0.999 5）范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好；平均回收率分別為100.08%和99.93%，RSD分別為1.12%和0.92%(n＝6）。結(jié)論 該方法可用于芒果葉的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；芒果葉；蘆丁；槲皮素

芒果葉為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的干燥葉[1]，其味酸、甘，性涼、平，具有行氣疏滯、去痧積的功能，主要用于治療熱滯腹痛、氣脹、小兒疳積、消渴等癥[2]。現(xiàn)代研究表明，芒果葉提取物具有平喘、止咳、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3－4]，芒果葉中含有槲皮素、蘆丁、抗壞血酸、鞣質(zhì)、芒果苷、高芒果苷、異芒果苷、沒食子酸等多種化學成分[3，5－6]。目前關于芒果葉化學成分含量測定的研究報道較少，僅見芒果苷、高芒果苷、沒食子酸、總黃酮、多糖、多酚等的測定[7－12]。本研究中查閱文獻[13－16]，建立了同時測定芒果葉中槲皮素與蘆丁含量的高效液相色譜（HPLC）法，方法簡便、準確，進一步完善了芒果葉的質(zhì)量控制體系。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元泵（G1311A）、自動進樣器 （G1313A）、柱溫箱（G1316A）、VWD檢測器（G1314A）、Agilent 1200 series色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；FA2240B型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；SB120D型超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ－200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（南京予凱儀器設備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海青浦瀘西儀器廠）；202型電熱恒溫干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；純化水系統(tǒng)（成都吉尼水處理設備研究所）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為10081－200501）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為10080－200707）；芒果葉采自攀枝花學院校園，經(jīng)攀枝花學院劉姍副教授鑒定為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的葉。甲醇，磷酸（成都長聯(lián)化工試劑有限公司）均為色譜純；高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：InertsilODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脫；體積流量：1.0 mL／min；檢測波長：368 nm；柱溫：35℃。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取蘆丁3.0 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，標為①；從①中量取10 mL，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋并定容至刻度，標為②；同法依次配得溶液③～⑦。槲皮素對照品溶液同法配制。

供試品溶液：稱取芒果葉樣品粉末(過3號篩)0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(200 W，45 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，用0.22 μm有機微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：在擬訂色譜條件下，將不同質(zhì)量濃度對照品溶液分別進樣10 μL，以對照品質(zhì)量濃度(X，μg／mL)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為蘆丁 Y＝17.787 X－8.595 4(R2＝0.9998)，槲皮素 Y＝65.207X－18.631(R2＝0.999 5)。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮素質(zhì)量濃度在1.46448～120μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別精密吸取2.2項下對照品溶液10 μL，注入色譜儀，在擬訂色譜條件下連續(xù)進樣6次。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為 0.27%和0.21%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，0.22 μm微孔濾膜過濾后，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣10 μL，在擬訂色譜條件下進行測定。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為0.49%和0.72%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一芒果葉樣品粉末6份，每份約3.0 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進樣10 μL。結(jié)果蘆丁、槲皮素峰面積的 RSD分別為0.21%和0.23% (n＝6)，表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的芒果葉樣品粉末6份，每份約 0.25 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁(37.75 μg／mL)對照品溶液1 mL、槲皮素(50.54 μg／mL)對照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進樣10 μL，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

稱取3批芒果葉樣品粉末，每批3份，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在擬訂色譜條件下進樣10 μL，測定。結(jié)果見表2。

3 討論

在優(yōu)化芒果葉藥材提取條件時，分別對提取方式（回流提取和超聲提取）、提取時間、提取溶劑進行了考察。分別以20，40，60，80 min進行回流提取和超聲提取。結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，芒果葉樣品中2種成分的含量逐漸增大，但 60 min后逐漸呈下降趨勢，從節(jié)約角度出發(fā)，最終確定以超聲提取 60 min為最佳。在提取溶劑的考察中，分別考察了2，4，6，8，10倍量體積的水和甲醇，結(jié)果表明，10倍量的甲醇提取效果最佳。

表2 樣品中蘆丁和槲皮素含量測定結(jié)果（n＝3，mg／g）

蘆丁、槲皮素經(jīng)過紫外吸收波長測定后，分別以355，365，368 nm作為HPLC檢測波長并進行比較。結(jié)果表明，在368 nm波長下，2種物質(zhì)的檢測靈敏度均較高，因此選擇368 nm作為檢測波長。

色譜條件優(yōu)化時，分別考察了甲醇和乙腈作為色譜流動相有機相，結(jié)果顯示，有機相為甲醇時，基線較平，干擾較小；考察了純水、乙酸、甲酸、磷酸、磷酸緩沖溶液作為流動相水相，結(jié)果顯示，磷酸可以顯著提高分離效果，但過多的磷酸加入會明顯增高基線。最終選擇70%甲醇－0.1%磷酸（65∶35）為組成的流動相系統(tǒng)。經(jīng)多次調(diào)整梯度洗脫程序，最終采用本研究中的梯度洗脫程序，能使所檢測的芒果葉樣品中這2種成分的色譜峰達到基線分離，峰形均較好，且分離度高。

芒果葉尚未被《中國藥典》收載，目前收載于《廣西中藥材標準》[2]，尚無含量檢測項。為進一步提升芒果葉的質(zhì)量控制水平，有必要對芒果葉的主要有效成分進行測定。蘆丁、槲皮素屬黃酮類，均具有較好的生物活性，本研究中建立的方法可同時對以上2種成分進行分析，該方法穩(wěn)定、準確、可靠，補充了現(xiàn)有文獻對芒果葉化學成分含量測定的不足，可用于芒果葉的質(zhì)量控制。下一步，可繼續(xù)對芒果葉其余有效成分的測定進行研究，有助于更全面地控制芒果葉藥材的質(zhì)量。

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Simultaneous Content Determination of Rutin and Quercetin in Folium M angiferae by HPLC

Xie Ziwei1,Li Qiang2,Liu Shan2
(1.Xindu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,China 610500; 2.Panzhihua University,Panzhihua,Sichuan,China 617000)

Objective To establish an HPLC method forthesimultaneouscontent determination of rutin and quercetin in Folium Mangiferae.M ethods The analysis was performed on Inertsil ODS－2 column (150 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase was 70% methanol－0.2% phosphoric(65∶35)with lsocratic elution,flow rate was 1.0 mL／min,detection wavelength was set at 368 nm,and column temperature was maintained at 35℃.Results The linear ranges of rutin and quercetin were 1.464 48－120 μg／mL(R2＝0.999 8,R2＝0.999 5),respectively.Their average recovery rateswere 100.08%(RSD＝1.12%,n＝6)and 99.93%(RSD＝0.92%, n＝6),respectively.Conclusion This method can be used for the quality control of Folium Mangiferae.

HPLC;folium mangiferae;rutin;quercetin

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2016)21－0034－03

謝紫薇（1981－），女，碩士研究生，高級工程師，主要從事中藥制劑質(zhì)量評價研究，（電子信箱）657064681＠qq.com；劉姍（1980－），女，博士研究生，副教授，主要從事藥用植物有效成分提取及藥用植物分子生物學及基因工程研究，本文通訊作者，（電子信箱）9549057＠qq.com。

2016－06－11；

2016－07－07)