正交試驗法優選黃馬酊最佳滲漉工藝

陳 薇，冷 靜，楊 敏，高 倩，王 琴

（1.重慶市中醫院，重慶 400021； 2.重慶醫科大學藥學院，重慶 400042）

正交試驗法優選黃馬酊最佳滲漉工藝

陳 薇1，冷 靜1，楊 敏1，高 倩2，王 琴1

（1.重慶市中醫院，重慶 400021； 2.重慶醫科大學藥學院，重慶 400042）

目的 優選黃馬酊的最佳滲漉提取工藝。方法 選擇乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）及滲漉速度（C）3個因素為考察對象，以士的寧及鹽酸小檗堿的含量為綜合評價指標，采用 L9（34）正交試驗進行優選。結果 以70%乙醇10倍量進行滲漉，滲漉速度為3 mL／（min·kg）為最佳工藝條件。結論 優選得到的黃馬酊滲漉工藝合理可行，可用于制劑室大生產。

黃馬酊；小檗堿；士的寧；滲漉；正交試驗

Chen Wei1,Leng Jing1,Yang Min1,Gao Qian2,Wang Qin1

(1.Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing,China 400021;

2.The Pharmacy College of Chongqing Medical University,Chongqing,China 400042)

黃馬酊是重慶市中醫院使用多年的臨床驗方，具有疏通經絡、活血止痛、解毒消腫、消瘀散結之功效，臨床主要外用于血管栓塞性脈管炎（中醫脫疽），有獨特療效。黃馬酊由酒黃連和制馬錢子2味中藥材組方，其中黃連主要指標成分為鹽酸小檗堿[1]285，馬錢子主要指標成分為士的寧[1]48，均為生物堿類，其醇溶性較水溶性好[2－3]，因此提取溶劑選用一定濃度的乙醇。常用的乙醇提取方法有浸漬法、滲漉法、回流法等，滲漉法有操作簡便、效率高等優點，適于醫院制劑室生產。為了保證制劑的質量和療效，本研究中以鹽酸小檗堿及士的寧的含量為評價指標[4]，采用正交試驗方法，對乙醇最佳滲漉工藝進行了考察。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫 1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；ODS－3 C18柱（北京迪馬歐泰科技發展中心）；DAD紫外檢測器；自制滲漉裝置；分析電子天秤（瑞士Mettler Toledo儀器公司）；Milli－Q Biocel A－10超純水制備系統（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

黃連對照藥材（批號為913－8902），馬錢子對照藥材（批號為 121164－200302），士的寧對照品（批號為110705－200306，供含量測定用，含量以97%計），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713－200609，供含量測定用，含量以98.5%計），以上試藥均由中國藥品生物制品檢定所提供；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ODS－3C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇－乙腈－0.1 mol／L磷酸二氫鈉及0.025 mol／L十二烷基硫酸鈉溶液（50∶25∶25）；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min。理論板數以士的寧峰計應不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

稱取士的寧和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含士的寧0.046 mg及鹽酸小檗堿0.097 mg的對照品混合溶液，即得對照品溶液。取處方比例的黃連粗粉、馬錢子粗粉，加相應濃度的乙醇潤濕，置滲濾桶中，浸漬48 h，調節流速，加乙醇至處方量，收集滲濾液，靜置，濾過，精密量取1 mL濾液，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得供試品溶液。取缺黃連陰性樣品、缺馬錢子陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：在擬訂色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測定。各峰之間分離度均大于1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線繪制：稱取士的寧對照品14 mg，鹽酸小檗堿對照品24 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取上述2種對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述系列對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定士的寧及鹽酸小檗堿的峰面積。以進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程。士的寧為Y＝2 563.9 X－18.393，R2＝0.999 4(n＝6)，士的寧進樣量在0.056～0.336 μg范圍內與峰面積線性關系良好；鹽酸小檗堿為 Y＝3 353.4 X－20.588，R2＝0.999 5 (n＝6)，鹽酸小檗堿進樣量在0.096～0.576 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，重復進樣5次。結果士的寧峰面積的 RSD為0.6%(n＝5)，鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為0.8%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，8，10 h時在擬定色譜條件下進樣檢測。結果士的寧峰面積的 RSD為 1.2%(n＝7)，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.4%(n＝7)，表明供試品溶液在10 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品5份，精密量取，依法制備5份供試品溶液，進樣測定。結果士的寧峰面積的RSD為 1.3%(n＝5)，鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為1.6%(n＝5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量（鹽酸小檗堿2.0 g／L，士的寧0.91 g／L）的樣品0.5 mL，置100 mL容量瓶中，再分別加入8，10，12 mL鹽酸小檗堿、士的寧對照品溶液（鹽酸小檗堿0.097 g／L，士的寧0.046 g／L），按擬訂方法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n＝9)

2.2 黃馬酊滲漉工藝優化

2.2.1 正交試驗結果

按處方比例稱取黃連粗粉、馬錢子粗粉，按2.1.2項下方法制備供試品溶液。以士的寧及鹽酸小檗堿的含量為綜合評價指標，對黃馬酊滲漉工藝進行優化。根據預試驗考察結果，選擇乙醇濃度（因素A），乙醇用量（因素B）及滲漉速度（因素C）3個因素，各取3個水平進行正交試驗。因素水平表及試驗結果見表2至表4。

2.2.2 結果分析

正交試驗結果表明，乙醇滲漉的影響因素為乙醇用量＞乙醇濃度＞滲漉速度，且以B2A2C3為最佳。方差分析結果表明，因素B有顯著影響，各因素影響大小順序為B＞A＞C，A和C無顯著影響，考慮到滲漉速度為1 mL／min（以1 kg藥材計），生產周期過長，故將因素C降低一個水平，即C2。故最佳工藝條件為A2B2C2，即以70%乙醇10倍量進行滲漉，滲漉速度為3mL／（min·kg）。

表2 因素水平表

2.2.3 驗證試驗

根據正交試驗優化所得最佳滲漉工藝條件，同法重復3次提取，所得士的寧及鹽酸小檗堿的含量結果見表5。結果表明，優化所得滲漉工藝條件合理可行、穩定可靠，具有可操作性和重復性。根據酒黃連藥材中鹽酸小檗堿含量為6.4%，制馬錢子藥材中士的寧含量為1.34%，可計算出黃連的提取轉移率為80.82%，制馬錢子的提取轉移率為82.34%。

表3 L9(34)正交試驗結果

表4 方差分析表

表5 最佳滲漉工藝驗證試驗結果

3 討論

黃馬酊作為醫院的傳統中藥制劑，在四肢血管科、內分泌科、皮膚科有著廣泛的應用，對糖尿病足潰瘍[5]、血管栓塞性脈管炎、肢端缺血壞死[6]、下肢慢性潰瘍[7]等具有良好的臨床效果，備受廣大患者青睞。

黃馬酊傳統制法為白酒浸泡，本研究采用乙醇為溶劑，采用正交試驗對酒黃連、制馬錢子制成的黃馬酊的提取方式進行優選，結果表明，以70%乙醇10倍量進行滲漉，滲漉速度為3 mL／(min·kg)，所得酊劑中士的寧及鹽酸小檗堿的含量較傳統的冷浸法高，略低于回流法所得含量。對于院內制劑，回流法不適于大生產，故選用滲漉法。

黃馬酊的傳統提取方法為白酒浸泡30 d，本研究對提取方法優選后3～4 d即可完成批量生產，明顯縮短了制劑所需時間，對于規范黃馬酊的制作工藝、指導醫院制劑生產具有一定意義。

黃馬酊屬于復方制劑，已知有效成分為鹽酸小檗堿、士的寧，是否還有其他成分存在，可否進一步濃縮提純，或開發其他更適用的劑型，值得進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2]段曉穎.正交試驗法優選馬錢子醇提工藝研究[J].中國現代應用藥學，2007，24(5):375－377.

[3]徐 媛，張 琰，劉新友，等.正交試驗法優選黃連中小檗堿提取工藝[J].中國中醫藥信息雜志，2011，18(5):60－62.

[4]陳 玲，敖 利.RP－HPLC測定通絡解毒凝膠劑中士的寧和鹽酸小檗堿的含量[J].中國中醫急癥，2012，21（8）:1 259－1 268.

[5]陳德清，朱丹平，邱子津，等.超聲清創術聯合黃馬酊治療糖尿病足潰瘍的臨床觀察[J].中國藥房，2015，27(26):3 660－3 662.

[6]張嗣蘭，黃建平，裴 玉，等.黃馬酒治療肢端缺血壞死、慢性潰瘍及實驗研究[J].中國中醫急癥，1997（1）:44－46.

[7]郭東梅.黃馬酊換藥治療下肢慢性潰瘍的護理干預及療效觀察[J].湖北中醫雜志，2012，20(9):30－31.

Optimum Percolation Extraction Process of Huang－Ma Tincture by Orthogonal Test Method

Objective To optimize the percolation extraction process of Huang－Ma Tincture.Methods The Ethanol concentration(A), Ethanol dosage(B)and percolation rate(C)were selected as the factors,and the contents of Strychnine and Berberine Hydrochloride were taken as the observed index;L9(34)orthogonal test was designed to optimize the process.Results The optimal technology was 70% ethanol 10 times as much as that of the drugs and percolation rate was 3 mL／(min·kg).Conclusion The preparation process is reasonable and highly efficient,which can be used for he mass production of Huang－Ma Tincture.

Huang－Ma Tincture;strychnine;berberine hydrochloride;percolation;orthogonal Test

R284.2；R282.71；TQ461

A

1006－4931(2016)21－0037－03

陳薇（1981－），女，碩士研究生，主管中藥師，主要從事方劑學研究，（電子信箱）1016487073＠qq.com；楊敏（1969－），男，大學本科，主任中藥師，主要從事醫院藥學管理研究，本文通訊作者，（電子信箱）453475345＠qq.com。

2016－05－18)