正交法優選具有抗巴氏桿菌活性黃連的提取工藝

裴青生 ， 曲 徑 ， 殷中瓊

(1.青海省畜牧獸醫科學院 ， 青海西寧810016 ； 2.四川農業大學動物醫學院 ， 四川成都611130)

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正交法優選具有抗巴氏桿菌活性黃連的提取工藝

裴青生1， 曲 徑2， 殷中瓊2

(1.青海省畜牧獸醫科學院 ， 青海西寧810016 ； 2.四川農業大學動物醫學院 ， 四川成都611130)

為了篩選出中藥黃連有效部位的最佳提取工藝，以提取物有效部位的浸膏得率與對巴氏桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度為綜合考察指標，采用正交實驗對提取工藝中的料液比、提取次數、提取時間、乙醇濃度4個因素進行優選研究。黃連有效部位的最佳提取方法為：70%乙醇，料液比1:12，提取次數2次，每次1 h。在該工藝條件下進行提取，中藥有效部位浸膏得率可以得到最大化保障，對巴氏桿菌的MIC和MBC值均小于等于15.6 mg/mL。

黃連 ； 有效部位 ； 正交試驗 ； 提取工藝 ； 巴氏桿菌

多殺性巴氏桿菌是一種重要的動物病原菌，對畜禽養殖業有較大的危害，可感染各種家畜、家禽及野生動物，引起禽霍亂、豬肺疫、牛羊兔馬及許多野生動物的敗血癥，并多與其他疾病混合感染或繼發，導致嚴重的經濟損失。目前主要采用抗生素進行治療，但隨著抗菌藥物的廣泛不合理應用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長促進劑以次治療劑量添加到飼料中，使巴氏桿菌表現為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點，不僅給治療和控制疾病帶來困難，而且加劇了抗生素在動物體內的殘留，嚴重危害了動物食品安全[1]。面對人類對健康的關注度越來越高，家畜家禽養殖行業中，綠色、無公害、無耐藥性的新抗菌中獸藥將逐步成為市場的主導。據研究報道，部分中藥對常見的幾種臨床致病菌有一定的抑制效果[2-3]。本研究前期試驗結果表明，黃連(RhizomaCoptidis)的有效部位提取物對巴氏桿菌有很好的抑菌效果。為了提高黃連對巴氏桿菌的抑菌活性，本研究對其有效部位的提取工藝進行優化，以便提高中藥有效物質的產量，達到更好的抑菌效果。

目前，在對黃連等中藥的提取工藝研究中，以測定中藥有效成分含量為指標的研究較多[6]，以浸膏得率為指標的提取工藝研究較少，綜合文獻資料，本研究以溶劑濃度、料液比、提取次數、提取時間為影響因素，采用正交實驗，以浸膏得率及對巴氏桿菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)為指標，根據綜合指標得到最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 藥材 黃連 RhizomaCoptidis(四川，批次080406)，購自成都中藥市場。

1.2 試驗菌種 巴氏桿菌Pasteurella(C481)，四川農業大學動物醫學院藥學系提供。

1.3 主要試劑 無水乙醇、二甲亞砜等，購自成都市科龍化工試劑廠；營養瓊脂、營養肉湯培養基等，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 黃連有效部位最佳提取工藝篩選 以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)及提取次數(D)為考察對象，并根據相關文獻[4]，擬定各因素的三水平(見表2)，以提取有效物質的浸膏得率，MIC和MBC值為綜合考察指標，選用L9(34)正交實驗表進行試驗，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規定量稱取藥物9份，每份約30 g，分別粉碎并編號1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9份藥物粉末，將藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，每組各提取1次，濃縮濾液至糊狀，放入55℃烘箱中3 d，烘干至浸膏狀態，稱重并計算得率，封存備用，分別重復9次。

表1 四因素三水平表

1.4.2 黃連對巴氏桿菌的體外藥敏試驗 細菌懸液的制備：對巴氏桿菌肉湯純培養物進行10倍遞減稀釋，平板計數后，制成菌懸液,并調整其濃度約為106cfu/mL(每毫升的菌落形成單位，Colony-formingunits/mL),備用。

抗菌藥液的制備：將黃連的中藥提取物浸膏溶于二甲亞砜中，配制成質量濃度為1 g/mL的儲備液，100 ℃高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存備用。

藥敏試驗：取無菌試管20支，分為試驗組和對照組，每組10支。無菌操作吸取l mL肉湯(含10%小牛血清)分別加于試驗組10支試管中，吸取已稀釋好的藥物1 mL加入第1管，混勻后依次倍比稀釋至第9管，使終濃度為1.95 mg/mL，第10管不加藥物為對照管。對照組操作同試驗組。用微量加樣器取已校正濃度的菌液0.1 mL，依次由低濃度向高濃度加到試驗組各管中，混勻后，置于37 ℃培養箱培養24 h后分別觀察細菌的生長狀況，以渾濁度為指標，以對照組為參考對象，檢查試管中有無細菌生長，以藥物最低濃度管中無細菌生長者為該試驗菌最低抑菌濃度MIC。將MIC測定中判定未生長細菌的試驗組中藥肉湯0.1 mL接種涂布于加小牛血清的營養瓊脂平板上，37 ℃條件下培養24 h，觀察結果，以未長細菌菌落的管內藥物濃度為最低殺菌濃度MBC[5]。

2 結果

2.1 黃連有效部位提取工藝的優選 通過對黃連提取物各浸膏得率的計算，得出每個正交號的浸膏得率，分別計算各組試驗結果的綜合平均值K1、K2、K3及極差R1；通過對巴氏桿菌抑菌活性和殺菌活性的測定，得出每個正交號的MIC、MBC值，以MIC及MBC的和為藥敏試驗結果考察指標，分別計算各組試驗結果的綜合平均值K1′、K2′、K3′及極差R2，并對其進行方差分析，結果見表2和表3。

表2 以浸膏得率和MIC與MBC值之和為指標的試驗L9(34)直觀分析

表3 以浸膏得率和MIC與MBC值之和為指標的試驗L9(34)的方差分析1

4個因素對黃連提取物得率的影響大小順序為：D>A>C>B，以得率為指標的最優水平組合為D2A2C1B3，即70%乙醇，料液比為1:12，提取2次，每次1 h。4個因素對MIC值與MBC值和的影響大小順序為：A>C>B>D，以MIC值與MBC值和為指標的最優水平組合為D3B3C3A3，即90%乙醇，料液比為1∶12，提取3次，每次2 h。

通過以上分析可知，篩選出的2個組合，因素水平的不同在于因素A、C、D，即乙醇濃度、提取時間、提取次數，其對得率影響最大，對藥敏影響很小。綜合以上分析，D2A2C1B3為提取黃連有效部位的最佳提取工藝因素水平組合，即70%乙醇，料液比1:12，提取次數2次，每次1 h。

2.2 最優組合的驗證 按最優組合對黃連有效部位進行提取，重復3次，計算每組得率、MIC和MBC值，其結果見表4。

表4 最佳提取工藝下的黃連提取物對巴氏桿菌的MIC和MBC值

由表4可得出，在最佳提取條件下，3次驗證試驗的得率非常接近，且均大于正交試驗組最高得率，MIC值和MBC值均屬于正交試驗中最小值或較小值。由此可知，正交試驗篩選出來的提取工藝為最佳工藝，且該提取工藝穩定，所得的綜合指標評價最好。

3 討論

本試驗主要是以提取物的浸膏得率及其對巴氏桿菌的MIC和MBC值作為評價指標，綜合探討了黃連有效部位的最佳提取工藝方法，為制劑的制備、質量標準的建立以及黃連與其他中藥復方治病機理的研究奠定基礎。

黃連有效部位提取工藝正交試驗結果表明，按照正交實驗設計原理，選擇提取時間、提取次數、料液比和溶媒濃度4個因素的3個不同水平，分別以有效部位的提取率及其對巴氏桿菌的MIC和MBC值作為評價標準，獲得了黃連有效部位的最佳提取工藝。按照中藥提取條件的常規設計[6]，料液比的設計為1∶5～30，提取次數越多提取越充分，而提取時間、溶媒濃度則與提取物的種類有關[7-8]。本研究結果中料液比、提取次數與常規提取設計相符合，表明了設計的合理性。黃連對巴氏桿菌標準菌的殺菌和抑菌結果表明，其具有較好作用，為臨床應用提供了依據。

本研究主要以對巴氏桿菌的抑菌和殺菌活性以及有效部位的得率為指標衡量提取方法的優越性，客觀上還有其他指標可以用來衡量提取工藝，比如主要成分得率、有效部位對其他類型致病菌的抑菌效果等，有關這部分內容以及對其制劑的開發、質量標準的建立以及確切療效的研究工作正在進行中。

[1] 張瓊文,楊昌宏,符曼萍.牛豬多殺性巴氏桿菌病的診治[J].中國獸醫雜志,2000.2:100-102.

[2] 袁心紅．16種中藥及其組方對臨床常見致病菌的抑菌作用探討[J]．中國中醫藥咨訊,2012,4(2):234-235.

[3] 劉榮欣,魯改儒,郭吉勇,等.中藥及其組方對大腸桿菌的體外抑菌試驗[J].安徽農業科學,2011,39(4):2265-2267.

[4] 涂瑤生,江志強,孫冬梅,等.黃連生物堿提取及純化工藝研究[J].中藥研究,2012(23)：208-209.

[5] 劉璐,陳靜,陳麗杰.黃芩、五倍子、黃連體外抑菌活性的研究[J].中國中醫藥科技,2011,18(5):424-425.

[6] 劉芳,劉斌,王毅.常規統計學方法在優化中藥提取工藝中的應用[J].中南藥學,2009,8(7)：615-617.

[7] 李文蘭,范玉奇,季宇彬,等.勻設計法優選川芎中阿魏酸和總酚酸的提取工藝[J].中國現代應用藥學雜志,2007,4(3)：98-201．

[8] 張穎,張兆旺.均勻設計法優選左金丸方藥的半仿生提取工藝[J].中國中藥雜志,2008,33(4)：466-469.

Extraction Technology ofantiPasteurellaactivity ofRhizomaCoptidisby Orthogonal design

PEI Qing-sheng1， QU Jing2， YIN Zhong-qiong2

(1.Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China;2.College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The aim of this study was to screen the best extraction procedure for antiPasteurellaactivity ofRhizomacoptidiseffective parts.The extract yield of effective parts,minimal inhibitory concentration(MIC)of extracts onPasteurellaand the minimum bactericidal concentration(MBC)of extacts onPasteurellawere used as the three indicators for comprehensive evalu-ation.The optimized extraction procedure was screened by orthogonal design with four factors,the solid-liquid ratio,extraction time,time of extractionand concentration of ethanol.Our result showed that the optimized concentration of ethanol was 70%,the solid-liquid ratio was 1:12,and the extraction time was 2 times of,1-hour extraction.In these conditions,Rhizomacoptidiseffective parts are maximum,and MIC and MBC values for pasteurella are less than or equal to 15.6 mg/mL.

Rhizomacoptidis； effective parts ； orthogonal design. ； extraction procedure ；Pasteurella

YIN Zhong-qiong

2015-11-12

“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2011BAD34B03);四川省青年科技創新研究團隊(2013TD0015);青海省科技計劃項目(2013-N-148)

裴青生(1960-)，男，副研究員，本科，主要從事動物生態養殖相關技術研究,E-mail:mkypqs@163.com

殷中瓊，E-mail：yinzhongq@163.com

R282

A

0529-6005(2016)10-0086-03