土龍祛疣洗劑對尖銳濕疣皮損microRNA表達的影響*

蘇傳麗，吳志洪，鐘 江，鄭恩金，黃 濤，岳天天

廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

土龍祛疣洗劑對尖銳濕疣皮損microRNA表達的影響*

蘇傳麗，吳志洪△，鐘 江，鄭恩金，黃 濤，岳天天

廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

目的:探討土龍祛疣洗劑對尖銳濕疣(CA)皮損標本中m i croRN A分子表達譜的影響。方法:以39例CA患者為觀察組，使用土龍祛疣洗劑熏洗治療，6周后觀察療效。以同期自本院外科就診的10例行包皮環切患者為對照組，取其正常包皮組織。采用qRT-PCR檢測2組5個炎癥相關m i croRN A(m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a和m i R-155)的表達情況。結果:39例CA患者治療6周后27例皮損消退明顯，癥狀減輕，總有效率為69.2%；觀察組m i R-203與正常對照組相比呈現低表達，土龍祛疣洗劑治療后呈現明顯上調，差異有統計學意義(P＜0.01)；m i R-21治療后表達量與治療前相比則下調明顯(P＜0.05)；而m i R-155、m i R-125b、m i R-146a分子在治療前后無明顯變化。結論:土龍祛疣洗劑治療尖銳濕疣療效肯定，可能通過下調m i R-21和上調m i R-203分子來發揮抗病毒的治療作用。

尖銳濕疣；人類乳頭瘤病毒；土龍祛疣洗劑；m i croRN A分子

微小RNA(microRNA，miRNA)是由約20～25個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼小RNA，通過與靶信使mRNA的3′末端非翻譯區堿基的部分互補配對，抑制mRNA翻譯或直接使其降解，在轉錄后水平抑制靶基因的表達。最近，越來越多的證據顯示miRNA與皮膚腫瘤和免疫炎癥性皮膚病的關系密切，miRNA介導的基因調控異常可能與角質形成細胞和免疫細胞的異常作用有關。Nuovo GJ等［1］在子宮頸乳頭瘤病毒(HPV)感染的宮頸上皮內瘤變早期HPV感染皮損細胞中發現miRNAs let-7c，-99a，26a和125b表達豐富，但在CIN-1級患者和尖銳濕疣患者皮損細胞miR-125b的表達明顯下降，而共轉染anti-miR-125b和HPV 16病毒則引起病毒DNA合成明顯增加。序列分析則顯示miR-125b和不同基因型的HPV病毒L2序列高度同源。Li B等［2］研究表明低表達miR-34a分子和高危HPV病毒基因型和宮頸癌密切相關，Au Yeung CL等［3］認為在宮頸癌中microRNA的反常表達與HPV病毒密切相關，在HPV感染相關的宮頸癌組織中miR-23b表達通常都降低。此外，miR-203是近年來發現的第一種皮膚特異性miRNA，研究發現miR-203分子在多種可能與HPV相關的腫瘤組織中表達異常，如子宮內膜癌［4］、基底細胞癌(BCC)［5］等，而且作為抑癌或致癌因子與靶基因共同作用參與腫瘤的發生發展。筆者臨床采用壯藥土龍祛疣洗劑治療尖銳濕疣(CA)療效滿意，為探討祛疣洗劑治療CA皮損組織中角質形成細胞凋亡與miRNA的關系，本研究應用實時定量PCR方法檢測39例CA患者在壯藥土龍祛疣洗劑治療前后皮損中相關5個炎癥相關microRNA(miR-21、miR-155、miR-125b、miR-146a和miR-203分子的表達水平，并對其結果進行分析，現報道如下:

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以廣西中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科2013年9月至2015年3月就診的39例CA患者(均經臨床及醋酸白試驗確診)為觀察組，其中男24例，女15例；年齡21～46歲，平均29.50歲；病程2～9周。以同期自本院外科就診的10例行包皮環切患者為對照組，取其正常包皮組織。本研究經廣西中醫藥大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審查后批準，患者知情同意。

1.2 治療方法 39例CA患者均使用祛疣洗劑治療(5例患者皮損直徑超過8 mm，先采用激光治療除去突出皮面疣體，再予祛疣洗劑治療)。祛疣洗劑(廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供)藥物組成:板藍根30 g，馬齒莧30 g，生薏苡仁30 g，廣木賊20 g，桃仁20 g，紅花20 g，乳香15g，紫草20g，香附20g，生牡蠣30g，枯礬15g。祛疣洗劑局部熏洗方法見文獻［6］。每2天治療1次，6周為1個療程，治療結束觀察疣體數目和大小的改善情況，進行療效評定。隨訪3個月，觀察復發率。

1.3 療效標準 基本治愈:疣體完全消失，2個月內無新疣體出現，癥狀全部消失，病理組織切片未見空泡化細胞。顯效:癥狀基本消失或全部消失，觀察2個月內無新的疣體。好轉:癥狀減輕，皮損數目較前減少。無效:臨床癥狀、體征無明顯改變，疣體數目或皮損面積的減少小于20%或繼續加重。如果患者癥狀消失后新發皮損，經醋酸白試驗陽性者判斷為復發。

1.4 皮損組織中 m i R-21、m i R-155、m i R-125b、m i R-146a和m i R-203表達水平檢測 采用直徑6 mm無菌鉆孔器鉆取土龍祛疣洗劑治療前后患者皮損組織標本，無菌PBS清洗后加入Trizol處理進行RNA抽提，然后使用分光光度計測量RNA的濃度和純度。選取D260/D280＞1.8和D260/D230＞2.0的RNA用于miRNAs分析，同時觀察各RNA樣品的光譜，確保所有用于miRNAs表達譜分析的RNA具有正常的光譜分布。以U6作為內參照，設計其特異性莖環反轉錄引物，引物序列見表1。參照反轉錄試劑盒說明書加樣，將RNA反轉錄成cDNA。然后以cDNA為模板，利用RFQ-PCR檢測試劑盒進行PCR擴增。PCR反應條件:95℃預變性10分鐘；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環；72℃延伸7分鐘。每個樣本設3個復孔。根據每孔熒光信號達到閾值時經歷的循環數作為Ct值，采用相對定量法(ΔCt=CtmiRNA-CtU6)，以2-ΔCt表示目的基因的相對表達量，各引物序列見表1。

表1 m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a 和m i R-155引物序列

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件包進行檢測結果的數據分析，計量資料采用(s)表示，miRNAs相對表達量的比較均采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

39例患者治療6周后27例癥狀減輕，皮損明顯好轉，總有效率為69.2%；其中臨床治愈12例，顯效15例，好轉9例，無效3例。RFQ-PCR檢測結果顯示，以U6為內參照，土龍祛疣洗劑治療后miR-203相對表達量與治療前相比上調顯著，差異有統計學意義 (P＜0.01)；miR-21治療后表達量與治療前相比則下調明顯(P＜0.05)，但仍高于對照組。miR-125b治療后相對表達量與治療前相比有所上調，但差異無統計學意義(P＞0.05)；miR-155和miR-146a治療前后的表達水平差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a和m i R-155 m RN A表達水平的檢測

3 討論

壯藥土龍祛疣洗劑以壯醫“調龍路火路”理論組方，為我院皮膚科鐘江主任的經驗方，外用治療病毒疣20余年，臨床療效顯著，尤其對復發患者，有激光、冷凍或其他藥物治療無法比擬的優勢。方由土龍根、木賊、馬齒莧、桃仁、紅花、香附、乳香、沒藥、牡蠣等組成。方中土龍根、木賊、馬齒莧為龍路火路藥，能通調龍路、火路，祛毒化濁、調噓勒(氣血)；桃仁、紅花、香附、乳香、沒藥、牡蠣能開塞通阻、散結消壅、通暢龍路火路。筆者經過臨床應用和觀察發現:在臨床上使用土龍祛疣洗劑治療的CA患者，大部分經歷了病毒疣皮損基底部發生輕度紅腫、輕度脫屑和瘙癢過程后，皮損徹底自然消退，而沒有這個過程的患者則復發嚴重。筆者多年臨床實踐結果表明，該方能有效調節機體免疫系統的功能活動，干預HPV病毒的復制與復發，具有其他藥物無法取代的優點和廣闊的應用前景，其調節信號的效應機制值得進一步研究。

壯藥土龍祛疣洗劑中所使用的土龍根、馬齒莧、廣木賊、廣薏苡仁等都是廣西道地壯藥，收錄于《廣西道地藥材》《壯醫特色療法》《實用壯醫內科學》等多部壯醫藥著作中。該方通過藥物對體表龍路、火路的刺激，疏通龍路、火路之瘀滯，祛毒外出，調整、“噓”(氣)、“勒”(血)、臟腑功能，恢復天、人、地三氣的同步運行，從而達到治病目的。該治療理論與現代醫學理論共同點都是要解決2個問題:一是消滅侵入的病原體，二是恢復正常的免疫力。雖然是外治，組方同樣講究解毒補虛并舉，認為藥物外用即可直接作用于病灶起到解毒蝕疣止癢的功效，又可通過皮膚、黏膜的吸收內達臟腑、血液，起到調理氣機、補虛扶正的作用。

國內有研究分析血清內5個炎癥相關miRNA分子(miR-21、miR-203、miR-125b、miR-146a和miR-155)隨HPV感染后宮頸病變進展的變化，結果表明血清內miR-21水平與未感染者相似，但持續感染者、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ患者血清內該分子表達均上調。血清內miR-146a分子表達水平隨HPV感染后宮頸病變發展而升高［7］。miR-155是一個典型的多功能miRNA，參與了血細胞生成、炎癥和免疫等多種生物學過程［8］。miR-146a是一個具有抗炎特性的NF-κB通道依賴型miRNA，也為一個具有多功能的miRNA分子主要在呼吸系統中起調控作用［9］。研究表明，在尖銳濕疣皮損標本內miR-21和miR-146a相對表達量的確明顯高于正常對照組，但經土龍祛疣洗劑治療前后對比發現miR-146a分子變化不明顯，miR-155治療前后的表達水平差異也不具有統計學意義，miR-125b治療后相對表達量雖與治療前相比有所上調，但差異無統計學意義，表明這3個分子在土龍祛疣洗劑治療作用中并未起主導的作用。而治療前miR-203與正常對照組相比呈現低表達(P＜0.05)，土龍祛疣洗劑治療后呈現明顯上調(P＜0.01)；miR-21則下調明顯(P＜0.05)，說明這2個分子在抗病毒免疫中可能起重要的作用。目前已有研究顯示具有癌基因作用的miR-21在HPV16陽性的宮頸癌中表達升高，且可能受HPV16的調節調控黏膜細胞的增殖［10］。Yang X等［11］通過體外實驗證明miR-21是TGF-β1誘導角質細胞移行重塑的關鍵分子，通過影響創面早期收縮和重塑期的膠原沉積在正常皮膚創傷的修復中起重要作用，因此我們推測土龍祛疣洗劑可通過miR-21分子促進HPV感染角質細胞的凋亡和重塑而起到治療作用。

miR-203是皮膚特異性的microRNA分子，在許多黏膜病毒感染性疾病例如卵巢癌、結腸癌、胰腺癌和鼻咽癌等腫瘤組織中高表達，并且對腫瘤的發生發展起到調控作用［12-13］。Feber等［14］通過miRNA芯片分析發現，miR-203a在食管癌組織中表達水平下調至正常組織的1/10～1/2；miR-203a基因啟動子區CpG島異常高甲基化導致其表達下調，提示miR-203a可能是抑癌基因。Jardim MJ等［15］分析哮喘患者支氣管黏膜細胞中 66個miRNAs分子，發現在皮膚黏膜細胞中miR-203下調程度最大，并且預測其靶基因為水通道基因AQP4，AQP-4與IFN-γ分子呈正相關。Buggele WA證實在Sendai病毒感染的人肺腺癌細胞系A549細胞系中，miR-203為IFN-γ可誘導的microRNA分子，可負向調控細胞內炎癥mRNA分子的表達包括IFN-γ受體基因［16］。HPV病毒主要侵犯皮膚黏膜角質細胞，且其引發皮損預后與角質細胞內干擾素相關誘導分子的關系密切。本研究發現壯藥土龍祛疣洗劑對尖銳濕疣患者皮損中miR-203分子的表達影響較大，明顯高出對其他miRNAs分子的影響，提示它在尖銳濕疣局部黏膜免疫中起著重要作用，其調控機制可能為干擾素相關靶基因通路，而miR-21分子介導的凋亡通路可能是土龍祛疣洗劑治療作用的另一個途徑。下一步我們將對比分析患者血液和皮損中相關炎癥因子和免疫分子的變化對這些miRNAs分子的作用做進一步研究，以期為尖銳濕疣的早期預防及治療提供有價值的分子靶點。

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Effects of TuLong QuYou Lotion on MicroRNA Expression of Condyloma Acuminatum Lesions

SU Chuanli,WU Zhihong△,ZHONG Jiang,ZHENG Enjin,HUANG Tao,YUE Tiantian
The First Affiliated Hospital Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China

Objective：To explore the effects of TuLong QuYou lotion on microRNA molecular expression profiles of the samples with condyloma acuminatum (CA)lesion.Methods：All 39 cases of the observation group were treated with TuLong QuYou lotion and the effects were observed in six weeks.Ten cases of the control group were treated with circumcision in surgical department of hospital,normal prepuce tissue was selected.Five inflammation-related microRNA(including miR-21,miR-203,miR-125b,miR-146a and miR-155)expressions in two groups were detected by qRT-PCR.Results：There were 27 cases with skin lesions and symptoms relived in six weeks after treating among 39 CA cases,and the total effective rate was 69.2%;when the observation group was compared with the control group in miR-203,the former was in low expression,the expression was up-regulated after treating by TuLong QuYou lotion,there was statistical difference(P＜0.01);miR-21 expression was down-regulated obviously after treatment compared with before(P＜0.05);there were no obvious changes in miR-155,miR-125b,miR-146a after and before treatment.Conclusion：The effects of TuLong QuYou lotion on CA are certain,and it shows antiviral function by down-regulating miR-21 and up-regulating miR-203 molecule.

CA;HPV;TuLong QuYou lotion;microRNA molecule

R752.5

A

1004-6852(2016)10-0001-04

2016-04-11

國家自然科學基金項目(編號81360599)；廣西自然科學基金項目(編號2013G X N SFA A 019148)；廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技立項課題(編號G ZZY 13-17)。

蘇傳麗(1981—)，女，碩士學位，副主任醫師。研究方向:變態免疫性皮膚病的免疫病理研究。

△通訊作者:吳志洪(1975—)，男，博士學位，副教授。研究方向:感染免疫性皮膚病的中西醫結合診治。