IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白對潰瘍性結腸炎模型小鼠的治療作用及其機制研究

陳堯，蔣小華，鄭萍，陶慶松

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.同濟大學附屬東方醫院 胃腸外科，上海 200120；3.東南大學附屬中大醫院 普通外科，江蘇 南京 210009； 4.同濟大學附屬東方醫院 消化內科，上海 200120)

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·論 著·

IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白對潰瘍性結腸炎模型小鼠的治療作用及其機制研究

陳堯1，蔣小華2，3，鄭萍4，陶慶松3

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.同濟大學附屬東方醫院 胃腸外科，上海 200120；3.東南大學附屬中大醫院 普通外科，江蘇 南京 210009； 4.同濟大學附屬東方醫院 消化內科，上海 200120)

目的:探討IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白(IL- 15 mutant/Fc)對潰瘍性結腸炎(UC)小鼠模型的治療作用及其可能的作用機制。 方法:5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)連續飲用制成UC模型，隨機將30只小鼠分為對照組、IL- 15 mutant/Fc治療組、IgG2a治療組，觀察小鼠一般體重情況。造模完成后取結腸行大體病理觀察，并行伊紅染色，查看其病理學損傷水平。ELISA分析小鼠眼球血的IL- 10、IL- 15、TNF- α炎癥因子的含量，RT- PCR測定結腸組織STAT3和STAT5 mRNA的表達，蛋白質印跡法測定磷酸化STAT5(p- STAT5)以及磷酸化AKT(p- AKT)蛋白的表達。結果:除對照組小鼠外，其他兩組均出現一般情況及體重改變。而IL- 15 mutant/Fc組小鼠的癥狀以及組織病理學評分均輕于IgG2a組。IL- 15 mutant/Fc可改善IL- 10、IL- 15、TNF- α的分泌情況。IL- 15 mutant/Fc抑制STAT5 mRNA、STAT3 mRNA表達以及p- STAT5、p- AKT蛋白的表達。結論：IL- 15 mutant/Fc在體內具有改善模型UC小鼠病情的作用，它可能通過特異性的拮抗IL- 15受體來干預STAT、AKT信號通路的信號轉導而發揮其治療作用。

融合蛋白； 模型潰瘍性結腸炎； 白細胞介素15； 小鼠

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)又稱非特異性潰瘍性結腸炎，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種類型。病變多數累及直腸和乙狀結腸。近幾年來，UC的發病率逐漸上升。目前UC的治療以藥物控制為主，氨基水楊酸及類固醇激素等傳統藥物對UC的治愈效果有限，外科手術也只限于病情嚴重者和并發癥的處理[1- 2],因此尋找更有效的藥物在UC治療研究中具有十分關鍵的作用。白介素15(interleukin- 15，IL- 15)1994年由Grabstein等[3]發現，其對眾多免疫細胞的發生發展、增殖分化都起到重要的調控作用，近年來，關于IL- 15與IBD發病的研究逐漸增多，已經證明IL- 15及其受體在IBD時表達明顯高于正常[4- 5]。IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白(IL- 15 mutant/Fc)是將點突變的IL- 15基因與鼠IgG2a恒定區融合構建的。IL- 15 mutant/Fc與IL- 15受體以極高的親和力特異性結合，從而起到IL- 15受體特異性拮抗劑的作用。研究表明IL- 15 mutant/Fc可以有效逆轉葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)小鼠模型中促炎和抑炎因子的比例[6]，并改善腸黏膜固有層組織病理學表現。本實驗通過構建UC小鼠模型，評價IL- 15 mutant/Fc對實驗性UC的治療效果，并進一步研究其對UC模型的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

6～8周齡Balb/c雌性小鼠，體重16～21 g，購自南京沐涂醫療科技有限公司，DSS購自上海前塵生物公司，IL- 15 mutant/Fc融合蛋白由東方醫院轉化醫學平臺構建。ELISA試劑盒購自eBioscience公司，Multiskan MK3酶標儀購自美國Thermo公司。ECL發光液購自美國Thermo公司。Trizol試劑購自TaKaRa公司。多聚酶鏈反應引物由南京墨跡公司合成。磷酸化STAT5(p- STAT5)抗體以及磷酸化AKT(p- AKT)抗體均產自R&D公司，定量PCR儀為ABI Stepone plus 熒光定量PCR系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 隨機將30只小鼠分為對照組、IL- 15 mutant/Fc治療組和IgG2a治療組各10只，對照組以正常飲用水連續飲用10 d，IL- 15 mutant/Fc治療組和IgG2a治療組按文獻[7]描述的以5%的DSS飲用水連續飲用7 d制備實驗性UC模型，造模3 d后IL- 15 mutant/Fc治療組和IgG2a治療組每只小鼠分別予IL- 15 mutant/Fc 5μg·(100μl·d)-1和IgG2a 5μg·(100μl·d)-1連續腹腔注射7 d。

1.2.2 小鼠結腸炎癥評價 察看并記錄小鼠每天的狀態及活動情況，觀察其糞便顏色及性狀等，記錄體重。于造模開始的第10天取完眼球血后全部處死并取距肛門1～5 cm處結腸,將取下組織行伊紅染色評估炎癥情況。根據Neurath等[8]的評分標準行組織病理評分，積分越高表明黏膜炎癥的嚴重程度越重。

1.2.3 ELISA檢測 眼球血中炎癥細胞因子IL- 10、IL- 15和TNF- α濃度的測定用ELISA法[9]。眼球血樣品室溫放置2 h后離心。取上清檢測，并以2倍法稀釋。同時分成空白孔、標準孔以及待測樣品孔。先在3組孔中注入稀釋液50μl。空白孔和另外兩孔中分別加入標準品和待檢測的樣品各50μl。所有組孔中加入生物素化的抗體50μl。37 ℃溫度下孵育2 h后將所有孔內液體甩干,并洗板3次，每孔加酶結合物100μl，蓋覆膜37 ℃溫浴1 h。將所有孔內液體甩干，洗板5次后加底物顯色液(TMB)100μl。37 ℃避光孵育30 min左右后所有孔中均加入終止試劑100μl。立即測量各孔的光密度。

1.2.4 RT- PCR檢測結腸組織STAT3及STAT5 mRNA的表達 Trizol法提取細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測其濃度。按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA后取2μl cDNA加入PCR體系中進行擴增，擴增條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。PCR引物序列見表1。擴增完成后將各樣品兩個不同的基因進行實時熒光定量PCR，再對各樣品所測得的基因量進行分析后得出基因相對含量。

表1 目的基因引物序列及大小

基 因引物序列片段大小/bpSTAT3F?GCCACGTTGGTGTTTCATAATC97R?TTCGAAGGTTGTGCTGATAGAGSTAT5F?CCGAAACCTCTGGAATCTGAA100R?GGTCTGGGAACACGTAGATAAGGAPDHF?GGTGTGAACCACGAGAAATATGAC127R?TCATGAGCCCTTCCACAATG

1.2.5 蛋白質印跡法檢測結腸組織p- STAT5和p- AKT蛋白的表達 提取蛋白完成后并測定其含量后進行電泳。電泳結束后進行轉膜，準備4張比膜稍小或一樣大的濾紙和1張PVDF膜，并將該膜置于甲醇溶液中活化1 min。在轉膜儀上，首先將已經泡好的兩層濾紙疊放在轉膜儀平臺上，并趕走中間的氣泡，然后將PVDF膜放于濾紙上。在PVDF膜上放置好分離膠以及2層濾紙后在0.32 mA的電流下轉膜2 h。將膜取出放置于一有封閉液的平皿中，室溫封閉4 h。棄封閉液，加入1∶1 000稀釋的多抗，4 ℃培養過夜。室溫下以TBST脫色搖床反復清洗3次。加入二抗，室溫下培養2 h后繼續清洗次數同上。加入增強化學發光(ECL)顯色液，于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片。以β- 肌動蛋白作為內參。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 一般情況及體重變化

IL- 15 mutant/Fc治療組和IgG2a治療組的小鼠在UC誘導當天即出現精神不振、活動減少等表現。第3天大便多為黏液型稀便，上述表現于第5天達到頂峰。IL- 15 mutant/Fc治療組部分小鼠第8天開始好轉，第1、5號小鼠分別于造模第8、9天死亡。IgG2a治療組癥狀未見明顯好轉，第1、2、6號小鼠于第8天死亡，實驗第10天后各組小鼠每天體重變化見圖1，統計分析顯示IL- 15 mutant/Fc治療組體重降低幅度小于IgG2a治療組(P<0.05)。

圖1 各組小鼠每天體重變化

2.2 結腸組織病理評分

對照組小鼠結腸組織未見病理學改變；IgG2a治療組小鼠結腸標本切片在光鏡下可見腸道增厚，黏膜及黏膜下層出現充血水腫，上皮細胞壞死脫落，黏膜層、黏膜下層甚至肌層內有大量炎癥細胞的浸潤，淋巴組織大量增生。隱窩損傷甚至消失；IL- 15 mutant/Fc治療組亦表現出黏膜充血、水腫,上皮細胞壞死脫落等改變，但病變程度明顯輕于IgG2a治療組，愈合較好(圖2)。3組的組織病理評分顯示：IL- 15 mutant/Fc治療組結腸炎病變評分為3.10±2.31，與對照組(0.00±0.00)比較結腸病變嚴重程度增加(P<0.05)；IgG2a治療組結腸炎病變評分為10.17±4.58，病變程度顯著重于對照組(P<0.01)；IL- 15 mutant/Fc治療組病變程度顯著低于IgG2a治療組(P<0.05)。

2.3 眼球血的IL- 10、IL- 15、TNF- α炎癥因子的表達

眼球血樣品于室溫放置2 h，取上清液經ELISA分析發現，細胞因子IL- 10、IL- 15、TNF- α均有表達。IL- 15 mutant/Fc融合蛋白組和IgG2a治療組IL- 15和TNF- α的表達均高于對照組(均P<0.05)，兩組IL- 10的表達均低于對照組(均P<0.05)；IL- 15 mutant/Fc融合蛋白治療組IL- 15和TNF- α的表達均低于IgG2a治療組(均P<0.05)，IL- 10的表達高于IgG2a治療組(P<0.05)。見表2。

圖2 各組小鼠結腸組織HE染色 ×200

表2 3組細胞因子的表達 pg·ml-1

a 與對照組比較，P<0.05； b 與IgG2a治療組比較，P<0.05

2.4 STAT3 mRNA、STAT5 mRNA、p- STAT5及p- AKT蛋白的表達

STAT3 mRNA表達水平IL- 15 mutant/Fc治療組低于IgG2a治療組(P<0.05)而略高于對照組(P>0.05)，IgG2a治療組高于對照組(P<0.05)(圖3A)。STAT5 mRNA表達水平IL- 15 mutant/Fc治療組低于IgG2a治療組(P<0.05)，IL- 15 mutant/Fc治療組及IgG2a治療組均高于對照組(均P<0.05)(圖3B)。p- AKT和p- STAT5蛋白表達水平IL- 15 mutant/Fc治療組低于IgG2a治療組及對照組(均P<0.05)(圖4A、B)。

A.STAT3 mRNA 相對表達量； B.STAT5 mRNA 相對表達量

圖3 各組小鼠結腸組織STAT3、STAT5 mRNA 相對表達量

A.p- AKT、AKT及β- 肌動蛋白的表達； B.p- STAT5、STAT5及β- 肌動蛋白的表達； 1.對照組； 2.IgG2a治療組； 3.IL- 15 mutant/Fc治療組

圖4 各組小鼠結腸標本p- AKT、AKT、p- STAT5、STAT5及β- 肌動蛋白的表達

3 討 論

對小鼠一般精神狀態、活動情況、體重、結腸組織的病理分析比較表明，IL- 15 mutant/Fc對UC有較好的治療作用，對其腸道改變也有一定的改善作用。IL- 15是一種炎癥促進因子和T細胞生長因子，主要由上皮細胞、內皮細胞等多種細胞產生，對許多細胞如單核/巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞的發生發展、增殖分化都起到重要的調控作用[6]。IL- 15與IL- 2具有相似生物學活性，它們都是T淋巴細胞生長的激活者、細胞毒效應細胞的誘導者，是T細胞的化學引誘物、NK細胞活化的刺激者，并且是IFN- γ和TNF- α產生的促進者[10]。所以IL- 15被認為不僅與固有性免疫有關，同時還兼顧著適應性免疫的發生發展[11- 12]。IL- 15 mutant/Fc是將點突變的IL- 15基因與鼠IgG2a恒定區融合，成功構建的IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白。Fc融合蛋白具有諸多明顯優勢[13- 14]，完整地保留了目標分子的全部生物活性，完全是自體的基因產物，抗原性極低，免疫球蛋白半衰期長，血漿濃度高，且具有潛在的引發免疫殺傷功能的特性，針對目標靶點的特異性強，親和力高。本實驗IL- 15 mutant/Fc治療組相較于IgG2a治療組促炎癥細胞因子IL- 15及TNF- α的分泌下降，而相關的炎癥抑制因子IL- 10的分泌上升。上述結果可以證明IL- 15 mutant/Fc或許對UC時炎癥細胞因子分化失衡起到了十分重要的干預作用。IL- 15 mutant/Fc治療組中IL- 15信號通路上的p- STAT5、p- AKT分子蛋白水平及STAT3、STAT5 mRNA的水平相較于IgG2a組顯著下降，IL- 15可與其受體相結合，激活STAT的信號通路，從而促進T細胞以及炎癥因子產物的增殖以及活化[15- 16]。而激活AKT這一通路后可以調整細胞發育生長中的增殖、分化和遷移[17- 18]。這些可能是UC發病的重要原因。本研究中，IL- 15 mutant/Fc治療組的STAT5 mRNA、STAT3 mRNA表達水平均低于IgG2a治療組，而p- STAT5及p- AKT蛋白表達水平低于IgG2a治療組。IL- 15 mutant/Fc抑制了STAT5、STAT3 mRNA及p- STAT5、p- AKT蛋白的表達，從而可能抑制了T細胞和炎癥因子產物的增殖及活化，減輕了黏膜的充血水腫情況，同時也就減輕了炎癥反應。

本實驗結果表明，IL- 15 mutant/Fc對UC小鼠有較好治療作用，其機制可能是參與下調IL- 15信號通路中發揮重要作用的信號分子STAT3、STAT5核酸或p- STAT5、p- AKT蛋白的表達，干預IL- 15下游重要通路的信號傳導，從而發揮治療作用。鑒于融合蛋白相較傳統單克隆抗體類生物制劑的明顯優勢,以及我們本實驗中顯示出的對UC動物模型炎癥因子表達譜紊亂及腸道炎癥的有效干預作用，這勢必進一步為融合蛋白應用于UC臨床靶向治療提供有力的理論和實驗支持。

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Therapeutic effect and mechanisms of IL- 15 mutant/Fcγ2a fusion protein in mice with ulcerative colitis

CHEN Yao1， JIANG Xiao- hua2，3，ZHENG Ping4，TAO Qing- song3

(1.School of Medicine，Southeast University，Nanjing 210009，China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery，EastHospital，TongjiUniversity，Shanghai200120，China； 3.DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 4.DepartmentofGastroenterology，EastHospital，TongjiUniversity，Shanghai200120，China)

Objective： To investigate the therapeutic effect and mechanisms of IL- 15 mutant/Fcγ2a fusion protein(IL- 15 mutant/Fc)in mice with ulcerative colitis(UC). Methods: Thirty mice were randomly divided into control group， IL- 15 mutant/Fc treatment group and IgG2a treatment group.UC model was induced in the latter two groups by giving 5% dextran sulphate sodium in drinking water for 7 consecutive days. In the experiment， the general condition and weight of the mice were observed，and the protective effects were evaluated by macroscopic and pathologic examinations. Hematoxylin- eosin(HE)staining of the distal colon mucosa of mice in each group was performed to study the histopathological injury and histological scores. The concentration of inflammatory cytokines(IL- 10，IL- 15，TNF- α) in ocular blood of mice was determined by ELISA assay. Expression of STAT3 and STAT5 mRNA and expression of p- STAT5 and p- AKT protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT- PCR) and Western Blot respectively. Results: Compared with the control group， mice in other two groups showed poor general conditions and changes in body weight，but the general conditions and histopathological score of mice in IL- 15 mutant/Fc treatment group were better than those in IgG2a treatment group. The secretion disorder of pro- inflammatory cytokines and anti- inflammatory cytokine could be partially alleviated by injection of IL- 15mutant/Fc demonstrated by increasing IL- 10 and decreasing IL- 15 and TNF- α. The levels of STAT3 and STAT5 mRNA， and of p- STAT5 and p- AKT protein in IL- 15 mutant/Fc treatment group were obviously lower than those in IgG2a treatment group(P<0.05). Conclusion: As a specific IL- 15 receptor antagonist， IL- 15 mutant/Fc can achieve its therapeutic effect on UC by intervening the signaling pathway through regulating the mRNA or protein expressions of key signal molecules， such as STAT and AKT．

fusion protein; ulcerative colitis model; interleukin- 15； mice

2016- 01- 20

2016- 03- 04

陳堯(1990-)，男，江蘇蘇州人，在讀碩士研究生。E- mail：cyssforever@126.com

蔣小華 E- mail：jxh@medmail.com.cn

陳堯，蔣小華，鄭萍，等.IL- 15 mutant/Fcγ2a融合蛋白對潰瘍性結腸炎模型小鼠的治療作用及其機制研究[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(4)：559- 564．

R574.62； R- 33

A

1671- 6264(2016)04- 0559- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.020