不同作用條件對納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響

王佳媚,章建浩

(1.海南大學 食品學院,海南 海口 570228;2.南京農業大學 食品科技學院,江蘇 南京 210095;3.江蘇省常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司,江蘇 常熟 215500)

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不同作用條件對納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響

王佳媚1,章建浩2,3*

(1.海南大學 食品學院,海南 海口 570228;2.南京農業大學 食品科技學院,江蘇 南京 210095;3.江蘇省常熟市屹浩食品包裝材料科技有限公司,江蘇 常熟 215500)

研究了不同作用條件對納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響。結果顯示:當納米二氧化鈦濃度增加時其對大腸桿菌(Escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerginosa)的抑菌作用呈先升高后降低的趨勢,最佳濃度值為0.4 g/L;光照強度越高,初始菌液濃度越低,納米二氧化鈦的光催化抑菌效果越好;在相同實驗條件下,納米二氧化鈦對大腸桿菌的抑菌效果優于對銅綠假單胞菌的抑菌效果。

納米二氧化鈦;光催化;大腸桿菌;銅綠假單胞菌；抑菌效果

目前,納米抗菌包裝是國際上抗菌包裝研究的熱點[1-4],多種金屬氧化物成為研究的熱點材料,如納米二氧化鈦[1]、ZnO[5]、CuO[6]。納米二氧化鈦的存在形式有銳鈦型、金紅石型和板鈦型,前兩者的存在形態非常穩定,是被研究最多的兩種形式。納米二氧化鈦經紫外光照射后,電子發生躍遷,并進一步生成活性自由基,從而具有氧化及抑菌活性。

納米二氧化鈦與薄膜材料結合制得復合膜,已經被證明對果蔬等產品中的微生物具有抑菌作用。用納米二氧化鈦與PVC混合,研制出的復合膜可有效延長富士蘋果的保存期[7]。將二氧化鈦或納米氧化硅粒子的復合保鮮液涂抹在枇杷表面,有效減少了腐敗率[8]。Chawengkijwanich C等[1]研究發現納米二氧化鈦涂膜包裝材料在處理180 min后使大腸桿菌的數量減少3 cfu/mL,其抑菌效果取決于UVA強度、光源種類等因素,與粒子的大小無關。二氧化鈦作為一種安全、無毒、低價、容易制得的物質,其光催化抑菌活性受到廣泛關注,在抗菌包裝材料中具有一定的應用價值。

關于納米二氧化鈦在不同作用條件下,對雞肉源微生物的光催化抑菌作用的研究很少。本文以UVA光照強度、二氧化鈦濃度、細菌濃度等為主要影響因素,研究了不同作用條件對納米二氧化鈦光催化抑菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 納米二氧化鈦光催化抑菌反應裝置

光催化抑菌反應實驗采用自制光催化裝置在密閉箱體中進行。反應裝置主要由磁力攪拌器、紫外燈和無菌燒杯組成。將反應溶液和催化劑加入無菌燒杯中,再將無菌燒杯放在磁力攪拌器上,用紫外燈(UVA)從上面垂直照射,光照強度根據實驗需要進行設定調節。使用數顯照度計直接測定光照強度。

1.2 反應菌液制備

用接種環分別挑取少量大腸桿菌(Escherichiacoli)K12和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerginosa)菌落，接種至無菌胰蛋白大豆肉湯(TSB)中,分別在適宜溫度下搖瓶培養24 h。取培養好的新鮮菌液50 mL,以5000g的轉速離心10 min,去掉上層液體培養基,用無菌PBS清洗菌體兩次,保證徹底除去培養基。再使用50 mL無菌PBS重新懸浮細菌體,所得菌懸液備用。

1.3 光催化抑菌實驗

用無菌蒸餾水將納米二氧化鈦配制成所需濃度的懸浮液；取45 mL納米二氧化鈦懸浮液與5 mL菌懸液至250 mL無菌燒杯中,然后將燒杯放在磁力攪拌器上,置于紫外燈下照射處理,處理過程中持續攪拌,每隔一段時間取樣檢測。

1.4 細菌菌落計數方法

對取出的樣品用無菌PBS溶液進行10倍系列梯度稀釋,選擇相鄰的3個梯度進行計數培養,計算菌落數量，觀察其變化。

分別取100 μL系列濃度的稀釋菌液在胰蛋白大豆培養基(TSA)上進行涂布；將涂布均勻的平板置于適宜溫度下培養一定時間(銅綠假單胞菌在25 ℃下培養48 h,大腸桿菌K12在37 ℃下培養24 h),然后對平板上的菌落進行計數。

1.5 數據分析

計算各處理多次重復實驗數據的平均值,使用Origin 9.0進行作圖和數據分析,使用SAS 8.2進行方差分析(ANOVA)及多方差檢驗(Tukey’s multiple range test,P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 納米二氧化鈦濃度對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

由圖1可見：納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌作用趨勢是基本一致的,在同一濃度下隨著照射時間的延長,納米二氧化鈦對兩種細菌的抑制效果均逐漸增強,活菌的濃度逐漸降低；在相同的照射時間條件下，不同濃度的二氧化鈦對兩種細菌的抑制作用均表現為0.4 g/L處理>0.8 g/L處理>0.2 g/L處理>對照(CK)。但在相同濃度、相同照射時間條件下，納米二氧化鈦對大腸桿菌的光催化抑菌效果要強于對銅綠假單胞菌的抑菌效果，例如在照射150 min時，0.4 g/L的納米二氧化鈦導致大腸桿菌的活菌數量比值(C/C0)低于10-4,而引起的銅綠假單胞菌的C/C0值低于10-3。總之，0.4 g/L的納米二氧化鈦在照射處理150 min時對兩種細菌均具有最好的抑制效果。

多重差異比較結果表明：不同濃度的納米二氧化鈦對大腸桿菌的抑制作用均顯著強于對照的(P<0.05)；在照射30 min時不同納米二氧化鈦濃度處理間對大腸桿菌的抑制作用差異不顯著;在照射60～90 min時,0.2 g/L的納米二氧化鈦對大腸桿菌的抑制作用顯著低于0.4 g/L和0.8 g/L的(P<0.05);在照射120～150 min時,0.4 g/L和0.8 g/L處理間的抑制作用差異不明顯,但兩者都顯著強于0.2 g/L處理和對照的。不同濃度的納米二氧化鈦對銅綠假單胞菌的抑制作用在照射30 min時無顯著差異；在照射60～150 min過程中, 0.2 g/L納米二氧化鈦的抑菌作用顯著低于0.4 g/L和0.8 g/L處理的(P<0.05)。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。光照強度為800 μW/cm2,菌液初始濃度為108 cfu/mL。

2.2 光照強度對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

圖2顯示在不同光照強度下納米二氧化鈦對銅綠假單胞菌的抑制作用趨勢與大腸桿菌相似,都隨著光照強度的升高而增大。在照射30 min之內納米二氧化鈦對兩種細菌的抑制作用均較弱；此后隨著照射時間的延長，其抑制作用明顯加強；當光照強度為600 μW/cm2時,經納米二氧化鈦作用150 min后大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數量比值均下降至10-2左右。

當光照強度為600 μW/cm2時, 0.4 g/L的納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用均顯著(P<0.05)低于高強度處理組的；當光照強度為1000 μW/cm2時,照射150 min時大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數量比值分別為10-5和10-4左右,而當光照強度為800 μW/cm2時,大腸桿菌和銅綠假單胞菌的活菌數量比值分別為10-4和10-3左右。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。二氧化鈦濃度為0.4 g/L,菌液初始濃度為108 cfu/mL。

2.3 菌液初始濃度對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的光催化抑菌效果的影響

從圖3可以看出：當菌液初始濃度為108cfu/mL時,納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用趨勢一致,在照射150 min內細菌濃度幾乎呈直線下降,其中大腸桿菌的濃度最終下降至104cfu/mL左右,而銅綠假單胞菌的濃度僅降至106cfu/mL左右。當菌液初始濃度為107cfu/mL時,大腸桿菌的濃度在照射150 min時降至102cfu/mL左右，而銅綠假單胞菌的濃度在前120 min呈快速降低,在120 min后下降速率明顯減弱,在150 min時濃度降至103cfu/mL左右；當菌液初始濃度為106cfu/mL時,大腸桿菌的濃度迅速降低,在120 min后濃度低于102cfu/mL，而銅綠假單胞菌的濃度變化類似于菌液初始濃度為107cfu/mL時的,在150 min時濃度下降至102cfu/mL左右。上述結果表明，菌液初始濃度越低，0.4 g/L的納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用越強。

A：大腸桿菌； B：銅綠假單胞菌。光照強度為800 μW/cm2,二氧化鈦濃度為0.4 g/L。

3 討論

3.1 納米二氧化鈦濃度對其光催化抑菌作用的影響

本實驗發現，納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌產生相同的抑菌效果所需時間相近,對大腸桿菌的抑制速度比銅綠假單胞菌快30 min。此結果與之前的報道[9-10]相似。納米二氧化鈦的作用濃度有最適值,即在一定濃度范圍內隨著二氧化鈦濃度的增加,其對細菌的作用增強,當超過某一濃度時,作用減弱。本研究中二氧化鈦的適宜濃度為0.4 g/L。這與Grieken等[9]報道的結果一致,他們發現：納米二氧化鈦懸浮液在0.02～0.50 g/L濃度范圍內,隨著濃度增加,納米二氧化鈦對微生物的抑制作用增強；納米二氧化鈦懸浮液在低濃度 (0.05 g/L)下抑制102cfu/mL大腸桿菌生長需要240 min;而當濃度為0.20 g/L時,其抑制106cfu/mL大腸桿菌生長僅需180 min。光催化抑菌作用的催化劑適宜濃度與實驗條件(照射燈的類型、反應器形狀)等有關,而與所用的目標菌種關系不大[11]。因為光催化反應過程比較復雜,反應過程中的影響因素較多,任一個因素的變化都可能會導致實驗結果不同。

當納米二氧化鈦濃度增加時,反應體系中的二氧化鈦分子數量增多,吸收的光子數量增加,產生的自由基數量增加,從而可以提高抑菌效果。當二氧化鈦濃度過高時,會產生屏蔽效應[12]。高濃度的納米二氧化鈦在細菌體表面形成大面覆蓋陰影,阻礙光線通過；此外,產生的活性電子——空穴對在短時間內不能與微生物作用,就會自動結合[12]。另外，過低濃度的納米二氧化鈦不足以吸收全部光子,產生的自由基數量有限,因而抑菌效果差。

3.2 光照強度對納米二氧化鈦抑菌作用的影響

光照強度影響整個光催化過程中納米二氧化鈦的抑菌效果,隨著光照強度的增加抑菌效果增加[13]。當光照強度降低時,導致納米二氧化鈦表面產生的自由基數量減少,對細菌的抑制效果降低。Rincón等[13]認為抑菌率隨催化劑用量的增加而增加,當光照強度為1000 W/m2時,增加納米二氧化鈦用量會影響光催化抑菌效果,因為抑菌作用需要足夠時間才能達到效果,并非菌體受到自由基攻擊之后立即達到抑菌效果。

本實驗結果表明，當光照強度增大時,納米二氧化鈦對細菌的抑制作用增強。這與之前關于二氧化鈦在水溶液中對大腸桿菌和E.faecalis抑制的報道結果[9]一致。當光照強度升高時,可利用的光能增大,納米二氧化鈦可吸收的光子增多,產生的自由基數量增多[14],從而增強對細菌的抑制效果。這可能也與光催化抑菌活性和氫氧自由基濃度間的線性關系有關[15]。在本研究中光照強度對兩種菌種的光催化作用影響趨勢一致,這可能與大腸桿菌和銅綠假單胞菌同屬G-菌、兩者的細胞結構相同有關。

3.3 菌液初始濃度對納米二氧化鈦抑菌作用的影響

在本實驗中，隨著菌液初始濃度的增大,納米二氧化鈦對細菌產生相同抑制效果所需的時間增加。此結果與相關文獻報道的結果[16-18]一致。圖3中高濃度與低濃度處理間細菌濃度變化曲線的斜率無顯著差異,說明反應速率常數隨菌液初始濃度的增加而減低。Grieken等[9]認為光催化抑菌的反應動力學常數與催化劑濃度和光照能量有關,但是反應速率與菌液初始濃度相關。

細菌的生長速度也會影響納米材料對細菌的光催化效果。生長速度快的細菌相對于生長速率慢的菌株而言可能對納米材料更敏感[19]。生長速率慢的細菌對納米粒子有較高的耐性,可能與其“抗壓基因”的表達有關[20]。因此,納米材料的抑菌作用隨使用菌株的不同而存在差異。

4 結論

納米二氧化鈦對大腸桿菌和銅綠假單胞菌均具有良好的光催化抑菌效果,在相同條件下對兩種細菌的作用趨勢一致，但對大腸桿菌的抑制作用強于對銅綠假單胞菌的。納米二氧化鈦濃度增加對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用均呈先升高后降低的趨勢,最佳濃度值為0.4 g/L。光照強度越高,菌液初始濃度越低,越有利于增強二氧化鈦的抑菌效果。

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(責任編輯:黃榮華)

Photocatalytic Disinfection Effect of Nano-TiO2on Bacteria under Different Conditions

WANG Jia-mei1, ZHANG Jian-hao2,3*

(1. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Changshu Yihao Food Packaging Material Technology Limited Company in Jiangsu Province, Changshu 215500, China)

The photocatalytic disinfection effect of nano-TiO2on 2 species of bacteria under different conditions was researched. The results indicated that the disinfection effect of nano-TiO2on bothEscherichiacoliandPseudomonasaerginosawas increased first and then decreased when the concentration of nano-TiO2was increased, and it showed the best disinfection effect at 0.4 g/L. To increase the light intensity, and to reduce the initial concentration of bacteria were helpful to increasing the disinfection effect of nano-TiO2. Under the same conditions, nano-TiO2had a better photocatalytic disinfection effect onE.colithanP.aerginosa.

Nano-TiO2; Photocatalysis;E.coli;P.aerginosa; Disinfection effect

2016-06-02

海南大學科研啟動基金項目(kyqd1560);國家中小企業創新基金項目(JSA9ED6Q);江蘇省農業科技自主創新資金項目(C X(15)1049);江蘇省國際合作項目(BZ2014034);國家科技支撐計劃項目“納米涂膜保鮮包裝材料的研究與開發”(2015 BAD16B05-05)。

王佳媚(1984─),女,講師,主要從事肉類加工與貯藏保鮮方向的研究。*通訊作者:章建浩。

TQ134.11

A

1001-8581(2016)11-0054-05