二氫楊梅素對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷炎癥反應的影響

鄧之婧， 陳家歡， 黃志明， 黃曉亮， 龐逸敏， 郭 哲， 何 萍

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二氫楊梅素對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷炎癥反應的影響

鄧之婧1， 陳家歡1， 黃志明1， 黃曉亮1， 龐逸敏1， 郭 哲2， 何 萍3

目的 觀察二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY) 對小鼠局灶性腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷后炎癥反應的影響。方法 雄性昆明種小鼠隨機分為3組，即假手術組、I/R模型組及DMY(500 mg/kg)組。改良線栓法制備小鼠大腦中動脈阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion / reperfusion，MCAO/R)局灶性腦缺血(3 h)再灌注(24 h)損傷模型。術前10 d開始灌胃給藥，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次。再灌注24 h后取腦，免疫組織化學檢測小膠質細胞標記物離子鈣接頭蛋白 (ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba1)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表達；ELISA法檢測缺血腦組織勻漿炎癥因子TNF-α和5-LOX代謝物白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)含量。結果 與模型組比較，DMY 500 mg/kg抑制小膠質細胞活化并降低TNF-α水平，降低缺血腦組織5-LOX蛋白表達并減少LTB4與CysLTs的產生(P<0.05或P<0.01)。結論 DMY可減輕局灶性腦I/R損傷炎癥反應，與抑制5-LOX有關。

二氫楊梅素； 腦缺血再灌注損傷； 炎癥反應； 5-脂氧合酶

炎癥反應是缺血性腦損傷的重要病理生理學機制之一，腦缺血損傷后的炎癥反應是腦缺血后組織持續損傷的重要原因[1]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)及其代謝產物白三烯物質如白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)在炎癥反應介導缺血性腦損傷的過程中起重要作用[2]。本課題組前期研究表明，二氫楊梅素 (Dihydromyricetin，DMY)對小鼠局灶性腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷具有保護作用，保護機制與其抗氧化作用有關[3]。本研究觀察DMY 對小鼠局灶性腦I/R損傷后5-LOX和炎癥反應的影響，以進一步探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性昆明種小鼠，體質量25～30 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要藥品與試劑 DMY(西安開來生物工程有限公司，純度98.33%，批號K130311)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成50 mgoml-1混懸液；異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，批號217151201)；兔抗鼠5-LOX多克隆抗體(美國Santa Cruz)；兔抗鼠離子鈣接頭蛋白)(ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba1)多克隆抗體標記小膠質/巨噬細胞(日本Wako)；SP免疫組織化學二抗試劑盒(北京中杉)；LTB4、CysLTs酶聯免疫試劑盒(上海江萊生物)，TNF-α 酶聯免疫試劑盒(武漢博士德)。

1.3 主要儀器設備 R580小動物麻醉機(瑞沃德生命科技有限公司)；XTZ-D解剖顯微鏡(上海光學五廠)；DMR+Q550病理圖像分析儀(德國Leica)；酶標儀(Molecular Devices)。

1.4 動物分組與給藥 42只小鼠隨機分為3組，即假手術組、I/R模型組及DMY(500 mg/kg)組，每組14只。DMY組在造模前10 d持續灌胃50 mg/ml DMY 10 ml/kg，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次；I/R模型組和假手術組同期灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

改良線栓法建立小鼠大腦中動脈阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)局灶性腦I/R損傷模型[4]。異氟烷吸入性麻醉后，分離結扎I/R模型小鼠左頸總動脈，在結扎處上方剪一小口，插入直徑0.20～0.23 mm的線栓，輕輕將線栓推進至大腦中動脈起始處，進線距頸總動脈分叉約0.8～0.9 cm，結扎固定栓線。缺血3 h后，再次異氟烷吸入性麻醉，小心拔出栓線并結扎頸總動脈殘端，再灌注24 h。假手術組只分離結扎左側頸總動脈，不插入線栓。

1.5 免疫組織化學檢測Iba1與5-LOX蛋白表達 再灌注24 h后，每組選小鼠6只，4%多聚甲醛全身灌注后取腦后固定24 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進行石蠟包埋，4 μm連續冠狀面切片。常規HE染色后，光鏡下觀察腦組織病理改變；同時按試劑說明書以SP法進行Iba1和5-LOX免疫組織化學染色。在每只小鼠皮質缺血灶隨機取4個相互不重疊的400×高倍鏡視野，計數其中的陽性產物面積。

1.6 酶聯免疫檢測缺血腦組織TNF-α和LTB4、CysLTs的含量 再灌注24 h后，每組另取小鼠8只，取小鼠缺血側腦組織進行勻漿，嚴格按照試劑盒說明分別測定腦組織勻漿中TNF-α和LTB4、CysLTs的含量。

2 結 果

2.1 DMY對小鼠缺血腦組織小膠質細胞活化的影響 見圖1，小鼠腦缺血再灌注24 h后，缺血周邊區出現Iba1陽性小膠質細胞。模型組缺血周邊區Iba1陽性產物面積(865.15±133.94 μm2/HP)，較假手術組(41.03± 13.48 μm2/HP)明顯增多(P<0.01)。與I/R模型組相比，DMY明顯降低缺血腦組織Iba1 (618.48±101.57 μm2/HP)的表達(P<0.01)。

2.2 DMY對小鼠缺血腦組織5-LOX表達的影響 見圖2，小鼠腦缺血再灌注24 h后，5-LOX陽性產物主要表達在缺血周邊區。I/R模型組缺血周邊區5-LOX陽性產物面積(1269.28± 214.33 μm2/HP)，比假手術組5-LOX陽性產物面積(28.61± 8.56 μm2oHP-1)顯著增高(P<0.01)。與I/R模型組相比，DMY明顯降低缺血腦組織5-LOX的表達(634.61±135.56 μm2oHP-1)(P<0.01)。

2.3 DMY對小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量的影響 與假手術組比較，I/R模型組小鼠缺血側腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量均明顯升高(均P<0.01)。與I/R模型組比較，DMY組降低小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量(P<0.05或P<0.01)(見表1)。

表1 DMY對腦I/R損傷小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量的影響

與假手術組比較，##P<0.01；與I/R模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 小鼠缺血腦組織Iba1表達(×400)

圖2 小鼠缺血腦組織5-LOX表達(×400)

3 討 論

二氫楊梅素是我國廣西和湖南省的壯族、瑤族民間習用草藥藤茶的主要黃酮類成分，含量高達27%左右，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性，且毒性小，近年來引起國內外學者的極大關注[5]。本課題組前期研究表明，DMY 500 mg/kg降低小鼠局灶性腦I/R損傷后神經功能損傷缺損評分、腦梗死體積和腦含水量，對局灶性腦I/R損傷具有保護作用[3]。

腦I/R損傷是一個復雜的級聯反應過程，涉及多種機制，其中腦損傷后炎癥反應在缺血性腦卒中的發生和發展過程中具關鍵作用，抗炎治療能有效減輕缺血性腦損傷，并有較寬的時間治療窗[1]。腦缺血損傷后有大量炎性細胞因子表達和炎性細胞浸潤，引起一系列炎癥反應，其過度表達可加重腦組織損傷。小膠質細胞是腦內主要的炎癥效應細胞，在正常腦組織中處于休眠狀態，腦缺血發生后，小膠質細胞迅速活化增殖，活化的小膠質細胞可分泌細胞毒性分子如一氧化氮、活性氧和促炎因子如TNF-a和IL-1β等，引起神經元損傷[6]。本研究中，DMY500 mg/kg可抑制小鼠缺血腦組織小膠質細胞活化并減少TNF-a產生，表明DMY對局灶性腦I/R損傷后炎癥反應具有抑制作用。

5-LOX是催化花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代謝生成白三烯的關鍵酶。白三烯是重要的炎癥介質，在腦缺血、腦外傷等中樞神經系統損傷性疾病中起重要作用。其中，LTB4是目前發現的最強的白細胞趨化因子和化學激動因子，使血管通透性增高，血漿滲出，并使白細胞向炎癥區聚集，介導腦缺血部位的炎性反應；LTB4 還可刺激單核/巨噬細胞和淋巴細胞合成和釋放IL-1β、TNF-α和IL-5等細胞因子，進一步激活炎癥反應[2]。CysLTs是很強的炎癥介質，介導平滑肌痙攣、微血管滲漏等，增加血腦屏障通透性和促進腦水腫形成。多種5-LOX抑制劑(如AA861、去甲二氫愈創木酸NDGA、齊留通、米諾環素、咖啡酸等)[7～10]等對缺血性腦損傷具有保護作用。研究報道DMY能顯著抑制由蛋白胨引起的腹腔炎癥大、小鼠中性粒細胞釋放LTB4及LTC4[11]。本研究中，腦I/R損傷導致缺血腦組織5-LOX表達及其代謝產物LTB4與CysLTs明顯增加；DMY 500 mg/kg可抑制缺血腦組織5-LOX表達并減少其代謝產物的產生，對缺血腦組織5-LOX具有抑制作用。

綜上所述，DMY可減輕局灶性腦I/R損傷后炎癥反應，其抗炎機制與抑制5-LOX、減少5-LOX代謝產物有關。DMY作為一種高效、低毒、價格低廉的中藥活性成分，有望成為新型的抗缺血性腦血管病的藥物。

[1]涂獻坤，楊衛忠，石松生. 炎癥反應介導缺血性腦損傷的機制研究進展[J]. 中華神經醫學雜志，2011，10(3)：322-324.

[2]許 琳，余 娟. 5-脂氧合酶與腦缺血/再灌注損傷關系的研究進展[J]. 醫學綜述，2010，16(10)：1468-1470.

[3]鄧之婧，陳永暢，柯晶晶，等. 二氫楊梅素對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2015，26(3)：209-302.

[4]陳永暢，鄧之婧，陳 誠，等. 小鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立與評價[J]. 中國當代醫藥，2014，21(15)：4-7.

[5]王文清，施春陽，童 慶，等. 二氫楊梅素藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2015，46(4)：603-609.

[6]段 樂，白利群，田苗苗，等. 炎癥反應在腦缺血中作用機制研究進展[J]. 中華實用診斷與治療雜志，2013，27(9)：837-839.

[7]Cieeri P，Rabuffetti M，MonoPoli A，et al. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral isehaemia in the rat[J]. British J Pharmocol，2001，133(8)：1323-1329.

[8]Shishido Y，Furushiro M，Hashimoto S，et al. Effect of nordihydroguaiaretieacid on behavioral impairment and neuron death after forebrain ischemia[J]. Pharmocol Biochemist Behav，2001，69(3/4)：469-474.

[9]Chu LS，Fang SH，Wei EQ，et al. Minocyeline inhibits 5-lipoxygenase activation and brain inflammation after cerebral ischemia in rats[J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28(6)：763-772.

[10]許 琳，余 涓，劉 穎，等. 5-脂氧合酶抑制劑zileuton對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報，2006，22(7)：853-855.

[11]梁 婷，吳春福，呂艷青，等. 二氫楊梅素對痤瘡丙酸桿菌和脂多糖誘發小鼠肝損傷的保護作用及對中性粒細胞釋放白三烯的影響[J]. 中草藥，2008，39(5)：83-87.

Dihydromyricetin Reduces Inflammatory Reaction Induced by Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

DENG Zhijing，CHENG Jiahuan，HUANG Zhiming，et al.

(Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective To study the influences of dihydromyricetin (DMY) on inflammatory reaction induced by focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury in mice. Methods Male Kunming mice were randomly divided into 3 groups：sham group，I/R group and DMY 500 mg/kg group. Mice model of middle cerebral artery occlusion (MCAO，3 h)/reperfusion (24 h) model was established by the improved intraluminal filament technique. Drugs were given orally 10 d(once a day)before the surgery，1 h before ischemia and 12 h after reperfusion. After reperfusion for 24 h，the expressions of ionized calcium binding adaptor molecule-1(Iba1) and 5-LOX in mice brain were assessed by immunohistochemistry；the contents of TNF-αand 5-LOX metabolites (LTB4 and CysLTs ) in ischemic brain tissue were detected by ELISA. Results Compared with the I/R group，DMY at 500 mg/kg could obviously inhibit the activation of microglia，lower the level of TNF-α，and reduce the expression of 5-LOX and the production of LTB4 and CysLTs (P<0.05或P<0.01). Conclusion DMY reduces inflammatory reaction induced by focal cerebral I/R injury，which might be associated with its inhibition on 5-LOX.

Dihydromyricetin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Inflammatory reaction； 5-Lipoxygenase

1003-2754(2016)11-0973-03

2016-07-20；

2016-09-17

國家自然科學基金(No. 81360056)；廣西自然科學基金面上項目(No. 2013GXNSFAA019147)；廣西自然科學基金回國基金項目(No. 2012GXNSFCA053005)；南寧市科學研究與技術開發計劃(No. 20153105)

(1.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第三附屬醫院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學實驗動物中心，廣西 南寧 530021)

郭 哲，E-mail：guozhe2301@163.com；何 萍，E-mail：hpnngxmu@163.com

R966；R743

A