轉化生長因子β1抑制肺動脈平滑肌細胞凋亡的機制研究Δ

劉 云，朱金權，孫增先（連云港市第一人民醫院藥學部，江蘇連云港 222002）

轉化生長因子β1抑制肺動脈平滑肌細胞凋亡的機制研究Δ

劉 云＊，朱金權，孫增先（#連云港市第一人民醫院藥學部，江蘇連云港 222002）

目的：研究轉化生長因子β1（TGF-β1）抑制肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）凋亡的可能機制。方法：以無血清培養基進行饑餓誘導（SD），MTT法檢測0.1、1、5、10 ng/ml的TGF-β1對SD誘導PASMCs細胞存活率的影響。Hoechst 33342染色觀察正常對照組、SD組、SD+LY294002[磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑]+TGF-β1組、SD+Wortmannin（PI3K抑制劑）+TGF-β1組、SD+TGF-β1組細胞凋亡情況。分別用Western blot法考察正常對照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細胞內蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p）-Akt蛋白的表達，正常對照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+LY294002+TGF-β1組細胞環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、p-CREB蛋白表達，正常對照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+Wortmannin組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞CREB和p-CREB蛋白表達，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。結果：與SD比較，TGF-β1作用后細胞存活率呈劑量依賴性增加，其中5、10 ng/ml質量濃度下細胞存活率差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞凋亡率均增加（P＜0.05）；與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。與正常對照組比較，TGF-β1組細胞內p-Akt蛋白表達增強，p-Akt/Akt增加；與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞內p-Akt蛋白表達增強，p-Akt/Akt增加。與正常對照組比較，SD組細胞內CREB蛋白表達減弱；與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞內CREB蛋白表達增強；與SD+TGF-β1組比較，SD+LY294002+TGF-β1組和SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞內CREB蛋白表達均減弱，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：TGF-β1可能通過激活PI3K/Akt信號通路抑制PASMCs凋亡。

肺動脈高壓；轉化生長因子β1；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B；凋亡

肺動脈高壓（PAH）是一種致命性疾病，其特點是肺血管過度收縮和平滑肌細胞增殖和凋亡失衡引起血管壁不規則重構。內皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞等過度分化增生，并積累到血管壁各層，會造成血管閉塞性病變、肺動脈壓及肺血管阻力升高、右心室后負荷增加，從而導致右心室衰竭，甚至死亡[1]。所以，肺血管重構的防治研究日益受到人們的重視。肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）增殖和凋亡的失衡是導致PASMCs增殖累積和肺部血管壁重構的重要因素之一，抑制PASMCs過度增殖、誘導其凋亡可以作為治療和控制PAH的有效方法。轉化生長因子β1（TGF-β1）是體內最強且最廣泛的促纖維化介質之一，具有調控細胞分化、增殖、凋亡的功能，其對軟骨組織代謝有重要作用[2]，也可促進PAH中肺血管重構過程[3-4]，但是其作用機制尚不清楚。Akt，亦被稱為蛋白激酶B（PKB），是一種分子質量為60 kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）依賴的方式調節多種細胞因子和生長因子，活化的PI3K/Akt通路調控細胞的生長與存活、增殖與凋亡、細胞遷移運動以及細胞周期等多種細胞活動和生物學效應。PI3K/Akt通路在PAH的發病機制中已有廣泛研究[5]。本研究假設TGF-β1通過PI3K/Akt通路抑制PASMCs凋亡從而引起PAH，現對其進行驗證。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；體視顯微鏡（上海光學儀器廠）；IX 70-SIF2型倒置顯微鏡、IX73-奧林帕斯倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；核酸蛋白定量儀（瑞士Amersshams公司）。

1.2 藥品與試劑

TGF-β1（美國PeproTech公司，批號：0719029，規格：2 μg/ml）；環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Santa公司）；Akt抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體、p-CREB抗體（美國Cell Signaling公司）；Hoechst 33342試劑盒、MTT試劑、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）和PI3K抑制劑LY294002、Wortmannin（碧云天生物技術研究所）。

1.3 動物

健康SD大鼠25只，♀♂不限，體質量160～200 g，鼠齡7～9周，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，購自北京維通利華動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 PASMCs的來源

常規麻醉大鼠，75%乙醇沖洗頸部和腹部，開胸，取完整的心肺組織放入培養皿內，分離肺動脈。將取出的肺動脈放入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）里，去除纖維外膜和內皮，剪成1～2 mm的組織塊，用1.5%Ⅱ型膠原酶消化1～2 h，直至組織塊變成細胞團，加入含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，終止消化，400×g離心5 min，棄上清，加入1 ml新鮮培養基重懸細胞，接種于細胞瓶中，常規靜置培養，待細胞生長達培養皿面積的80%左右對其進行傳代培養。

2.2 MTT法檢測PASMCs存活率

收集對數期PASMCs，胰酶消化，用培養液配成細胞懸液，加至96孔板中，調整細胞數為每孔5 000～10 000個，鋪板后置于溫箱中培養24 h，分別加入含0.1、1、5、10 ng/ml TGF-β1的無血清DMEM培養基，每個質量濃度6個復孔。另取6個孔加入不含TGF-β1的無血清DMEM培養基進行饑餓誘導（記為SD）。共同孵育48 h后，加入20 ml MTT試劑，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 ml二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀492 nm處測定吸光度值，計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝（加藥孔吸光度－本底吸光度）/（對照孔吸光度－本底吸光度）×100%。

2.3 Hoechst 33342染色觀察PASMCs的凋亡情況

收集對數期PASMCs，待細胞生長達培養皿面積70%左右對其進行饑餓誘導24 h，然后分為正常對照組、SD組、SD+ LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組、SD+TGF-β1組，每組6個復孔，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。除正常對照組細胞加入含20%FBS的DMEM培養基外，其余各組細胞分別加入相應含藥或不含藥的無血清DMEM培養基。培養24 h后，棄培養液，用PBS洗3次，每次5 min，棄PBS，加入Hoechst 33342染料與細胞共同孵育20 min。加入抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀察藍色熒光產生情況，評價細胞凋亡情況，激發波長為352 nm，發射波長為400～500 nm。

2.4 Western blot法檢測PASMCs內Akt、p-Akt、CREB和p-CREB蛋白表達

收集對數期PASMCs，待細胞生長達培養皿面積70%左右對其進行饑餓誘導24 h，然后分為正常對照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+Wortmannin組、SD+ LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組，每組4個復孔，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。除正常對照組和TGF-β1組細胞加入20%FBS DMEM培養基外，其余各組細胞分別加入相應含藥或不含藥的無血清DMEM培養基。作用24 h后，棄培養液，用PBS洗3次，加入細胞蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，收集液體，超聲破碎細胞，3 000×g離心15 min后收集上清。根據Bradford法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，200 mA恒流轉膜1.5 h。轉膜完畢后，取出膜放入平皿中的TBST緩沖液中，搖洗5 min，洗凈轉膜液，封閉1 h后取出膜，再用TBST緩沖液洗5 min，加入Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）一抗（溶于3%牛血清白蛋白），4℃過夜孵育。一抗孵育完畢后，用TBST緩沖液洗30 min，然后將HRP標記山羊抗兔二抗溶于5%脫脂牛奶中（1∶5 000），室溫孵育1 h，二抗孵育完畢后，TBST緩沖液洗30 min。均勻滴加增強化學發光（ECL）試劑的A、B液（1∶1）混合液，靜置5 min，放入凝膠成像儀曝光，Quantity One軟件分析光密度（OD）。以目的蛋白灰度值與β-actin（內參）灰度值的比值表示目的蛋白的相對含量[6]。分別考察正常對照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細胞內Akt、p-Akt蛋白的表達，正常對照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+ LY294002+TGF-β1組細胞CREB、p-CREB蛋白表達，正常對照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+Wortmannin組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞CREB、p-CREB蛋白表達。

2.5 統計學方法

采用Microsoft Excel軟件進行分析。計量結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞存活率

0.1 、1、5、10 ng/ml TGF-β1和SD作用后PASMCs存活率分別為（62.65±3.76）%、（66.07±3.81）%、（83.46±4.80）%、（91.59±1.43）%、（63.12±2.64）%（n＝6）。與SD比較，加入TGF-β1作用后的PASMCs存活率呈劑量依賴性升高，其中5、10 ng/ml質量濃度下細胞存活率差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.2 細胞凋亡情況

正常對照組、SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組、SD+TGF-β1組PASMCs凋亡率分別為（4.83±0.60）%、（37.83±1.14）%、（34.50±1.33）%、（34.00± 1.59）%、（16.83±0.95）%（n＝6）。與正常對照組的正常細胞（圖1a）比較，SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞在核染色質形態上有明顯改變，例如細胞核呈鋸齒狀，部分染色質出現濃縮狀態（見圖1b1）；細胞核的染色質高度凝集、邊緣化（見圖1b2）；細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體（見圖1b3），這些形態的發生提示細胞的凋亡數均增加（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞凋亡數明顯減少（P＜0.05）。各組細胞的凋亡染色圖見圖1。

3.3 細胞內Akt、p-Akt蛋白表達

正常對照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細胞內p-Akt/Akt分別為1±0、0.61±0.04、1.48±0.12、1.02±0.06（n＝4）。與正常對照組比較，TGF-β1組細胞內p-Akt蛋白表達增強，p-Akt/Akt增加（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞內p-Akt蛋白表達增強，p-Akt/Akt增加（P＜0.05）。各組細胞內Akt、p-Akt蛋白表達的電泳圖見圖2。

圖1 各組細胞的凋亡染色圖Fig 1 Apoptosis staining of cells in each group

圖2 各組細胞內Akt、p-Akt蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of the protein expression of Akt and p-Akt of cells in each group

3.4 細胞內CREB、p-CREB蛋白表達變化

與正常對照組比較，SD組細胞內CREB蛋白表達減弱（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細胞內CREB蛋白表達增強（P＜0.05）。與SD+TGF-β1組比較，SD+LY294002+ TGF-β1組和SD+Wortmannin+TGF-β1組細胞內CREB蛋白表達均減弱（P＜0.05）。各組細胞內CREB、p-CREB蛋白表達的電泳圖見圖3，檢測結果見表1。

圖3 各組細胞內p-CREB、CREB蛋白表達的電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of the protein expression of p-CREB and CREB of cells in each group

4 討論

TGF-β1是肺形態形成、肺纖維化發病、血管重構重要的調節因子。筆者以往研究發現，TGF-β1參與肺動脈血管重構，且在缺氧鼠肺動脈中過表達[3]。目前研究中，筆者發現TGF-β1可誘導Akt磷酸化，提示PI3K/Akt通路在TGF-β1抑制PASMCs凋亡中是必要的。

表1 各組細胞內CREB蛋白表達及p-CREB/CREB的檢測結果（±s，n＝4）Tab 1 The protein expression of CREB and p-CREB/CREB of cells in each grou（p±s，n＝4）

表1 各組細胞內CREB蛋白表達及p-CREB/CREB的檢測結果（±s，n＝4）Tab 1 The protein expression of CREB and p-CREB/CREB of cells in each grou（p±s，n＝4）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與SD組比較，#P＜0.05；與SD+ TGF-β1組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.SD group，#P＜0.05；vs.SD+TGF-β1group，ΔP＜0.05

組別正常對照組SD組SD+TGF-β1組SD+LY294002組SD+LY294002+ TGF-β1組CREB/GAPDH 1.42±0.11 0.90±0.08＊1.24±0.08#0.80±0.01 0.73±0.03Δp-CREB/CREB 1.02±0.06 0.92±0.06 1.00±0.07 1.07±0.03 0.95±0.09組別正常對照組SD組SD+TGF-β1組SD+Wortmannin組SD+Wortmannin+ TGF-β1組CREB/GAPDH 1.47±0.03 0.83±0.06＊1.24±0.10#0.78±0.07 0.75±0.05Δp-CREB/CREB 0.90±0.05 1.04±0.03 0.98±0.02 1.10±0.07 1.05±0.07

CREB是一種缺氧敏感的轉錄因子，可選擇性結合環磷酸腺苷反應元件（CREs）的核蛋白。缺氧可以激活CREB的高表達，CREB已經被認為是PAH血管平滑肌細胞增殖的一個指標[7]。筆者研究發現，TGF-β1不僅可增加CREB磷酸化而且也可加強CREB總蛋白表達，抑制PASMCs中PI3K/Akt通路后，CREB表達受到抑制，而p-CREB/CREB的比例沒有發生變化，表明CREB磷酸化水平增加歸功于總蛋白水平增加。

綜上所述，PI3K/Akt通路涉及到TGF-β1誘導的PAH，這一研究為TGF-β1抑制PASMCs凋亡找到了新的信號轉導通路和機制。TGF-β1調節PI3K/Akt通路可能是治療PAH的重要機制，為將來治療PAH提供了新的靶點。

[1] Crosswhite P，Sun Z.Molecular mechanisms of pulmonary arterial remodeling[J].Mol Med，2014，20（1）：191.

[2] 郭鐵峰，周明旺，李盛華，等.轉化生長因子β1對軟骨組織代謝影響的研究進展[J].中國組織工程研究，2013，17（15）：2 827.

[3] Liu Y，Ma C，Zhang Q，et al.The key role of transforming growth factor-beta receptorⅠand 15-lipoxygenase in hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells[J].Int J Biochem Cell Biol，2012，44（7）：1 184.

[4] Liu Y，Cao Y，Sun S，et al.Transforming growth factorbeta1 upregulation triggers pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and apoptosis imbalance in rats with hypoxic pulmonary hypertension via the PTEN/Akt pathways[J].Int J Biochem Cell Biol，2016，77（PtA）：141.

[5] Zhang H，Gong Y，Wang Z，et al.Apelin inhibits the proliferation and migration of rat PASMCs via the activation of PI3K/Akt/mTOR signal and the inhibition of autophagy under hypoxia[J].J Cell Mol Med，2014，18（3）：542.

[6] 李麗艷，俞金正，沈群.黃芪顆粒對病毒性心肌炎模型大鼠心肌細胞中Cav-3、Smad3表達的影響[J].中國藥房，2016，27（25）：3 509.

[7] Yu SH，Chen JY，Zhang YM，et al.Effect of thoracic epidural blockade on hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in rats[J].Iran J Basic Med Sci，2014，17（9）：710.

Study on the Mechanism of TGF-β1Inhibiting the Apoptosis of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells

LIU Yun，ZHU Jinquan，SUN Zengxian（Dept.of Pharmacy，the First People’s Hospital of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222002，China）

OBJECTIVE：To study the potential mechanism of TGF-β1inhibiting the apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells（PASMCs）.METHODS：The serum free medium was used for serum deprivation（SD）；MTT assay was used to detect the effects of 0.1，1，5，10 ng/ml TGF-β1on the survival rate of PASMCs.The apoptosis of PASMCs were observed by Hoechst 33342 staining in normal control group，SD group，SD+LY294002[PI3K inhibitor]+TGF-β1group，SD+Wortmannin（PI3K inhibitor）+TGF-β1group and SD+TGF-β1group.Western blot technique was applied to investigate the protein expression of Akt and p-Akt in normal control group，SD group，TGF-β1group and SD+TGF-β1group；the protein expression of CREB and p-CREB were investigated in normal control group，SD group，SD+TGF-β1group，SD+LY294002 group and SD+LY294002+TGF-β1group；the protein expression of CREB and p-CREB were investigated in normal control group，SD group，SD+TGF-β1group，SD+Wortmannin group and SD+Wortmannin+TGF-β1group.The concentrations of LY294002，Wortmannin and TGF-β1were 10 μmol/L，50 nmol/L，10 ng/ml，respectively.RESULTS：Compared with SD，survival rate of PASMCs increased as dosage after treated by TGF-β1，with statistical significance at 5，10 ng/ml（P＜0.05）.Compared with normal control group，apoptotic rate of PASMCs increased in SD group，SD+LY294002+TGF-β1group and SD+Wortmannin+TGF-β1group（P＜0.05）；compared with SD group，the apoptotic rate of PASMCs decreased in SD+TGF-β1group（P＜0.05）.Compared with normal control group，the protein expression of p-Akt and p-Akt/Akt ratio increased in TGF-β1group；compared with SD group，the protein expression of p-Akt and p-Akt/Akt ratio increased in SD+TGF-β1group.Compared with normal control group，the protein expression of CREB decreased in SD group；compared with SD group，the protein expression of CREB increased in SD+TGF-β1group；compared with SD+TGF-β1group，the protein expression of CREB decreased in SD+LY294002+TGF-β1group and SD+Wortmannin+TGF-β1group，with statistical significance（P＜0.05）.CONCLUSIONS：TGF-β1can inhibit the apoptosis of PASMCs by activating PI3K/Akt signaling pathway.

Pulmonary arterial hypertension；TGF-β1；PI3K/Akt；Apoptosis

R965

A

1001-0408（2016）34-4784-03

2016-07-29

2016-10-26）

（編輯：鄒麗娟）

江蘇省自然科學基金面上項目（No.BK20161297）；連云港市第一人民醫院博士科研啟動基金項目（No.BS15012）

＊主管藥師，博士。研究方向：肺動脈高壓發病機制。電話：0518-85605518。E-mail：yunliu211315@163.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學。電話：0518-85605518。E-mail：sunzx715@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.10