葛根素對表柔比星致H9c2心肌細胞凋亡的影響

李 聰，周 捷，黃海潮，巫 瑋，李 園（.廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院藥學部，廣州 50080；.中山大學腫瘤防治中心藥學部，廣州 50060；.廣東食品藥品職業學院實驗實訓中心，廣州 5050；.廣東省食品藥品職業技術學校藥學系，廣州 5066）

葛根素對表柔比星致H9c2心肌細胞凋亡的影響

李 聰1＊，周 捷2，黃海潮3，巫 瑋4，李 園1（#1.廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院藥學部，廣州 510080；2.中山大學腫瘤防治中心藥學部，廣州 510060；3.廣東食品藥品職業學院實驗實訓中心，廣州 510520；4.廣東省食品藥品職業技術學校藥學系，廣州 510663）

目的：研究葛根素對表柔比星致H9c2心肌細胞凋亡的影響。方法：取H9c2心肌細胞分為空白對照組、模型組、陽性對照組（10 μmol/L右丙亞胺）和葛根素低、中、高濃度組（10、50、100 μmol/L），每組5個復孔。除空白對照組不作任何處理外，其他各組細胞加入表柔比星（1.0 μmol/L）及相應藥物，作用24 h后，采用CCK-8法檢測細胞存活率，Hoechst 33258染色觀察細胞的凋亡形態，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測凋亡相關信號蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3的表達，比色法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）的含量。結果：與空白對照組比較，模型組細胞核出現明顯的凋亡小體，細胞存活率、Bcl-2表達、SOD活性均降低，凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3表達、Bax/Bcl-2比例、MDA含量均增加；與模型組比較，陽性對照組和葛根素中、高濃度組細胞核形態完整，細胞存活率、Bcl-2表達、SOD活性均增加，凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3表達、Bax/Bcl-2比例、MDA含量均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其余指標差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：葛根素可能通過抑制細胞凋亡信號通路和減輕氧化損傷作用來降低表柔比星的心肌毒性。

葛根素；表柔比星；H9c2心肌細胞；心肌毒性

表柔比星（Epirubicin）屬于蒽環類抗腫瘤藥物，廣泛應用于治療白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌等多種腫瘤疾病。盡管表柔比星具有顯著的抗腫瘤作用，但其心臟毒性的危害程度甚高，主要表現為心律失常、心功能紊亂、充血性心力衰竭，甚至導致患者死亡[1]。有研究表明，其心臟毒性主要是因為體內的表柔比星在細胞色素P450等酶的作用下轉可變為半醌表柔比星，半醌結構所帶的孤對電子可傳遞給分子氧形成超氧陰離子自由基（·O2－），產生的·O2－又可進一步轉化為羥自由基、過氧化氫等多種自由基，從而使細胞膜及細胞器膜磷脂中的不飽和脂肪酸發生過氧化反應，破壞膜結構完整性并改變膜上蛋白的功能，從而嚴重影響心肌細胞的正常功能[2]。

葛根素（Puerarin）是從豆科植物野葛根中提取的黃酮苷，具有清除自由基、抗脂質過氧化和改善心肌能量代謝等作用，由此推測，葛根素可能用于降低表柔比星的心肌毒性[3]。本文利用H9c2心肌細胞株探討葛根素對表柔比星心肌毒性的抑制作用及機制，并以目前廣泛使用的預防蒽環類藥物心肌毒性的保護劑右丙亞胺作為對照，比較兩者對心肌的保護效果。

1 材料

1.1 儀器

HERA Cell 150i CO2細胞培養箱、Sorvall ST 40臺式離心機（美國Thermo Scientific公司）；DMI3000B熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Elx-808酶標儀（美國Bio-Tek公司）；BD FACSVerse流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素（批號：031M1302V，純度：＞99.0%）、表柔比星（批號：038K1349，純度：98%）、Hoechst 33258染色試劑（批號：3491-45-4）均購自美國Sigma Aldrich公司；右丙亞胺注射劑（江蘇奧賽康藥業有限公司，批號：E1511042，規格：每支250 mg）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo Lab公司）；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM干粉培養基（美國Gibco公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；凋亡相關信號蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3和β-肌動蛋白（β-actin）、兔抗鼠抗體以及羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology Inc公司）。

1.3 細胞株

鼠源性H9c2心肌細胞株由中山大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 H9c2細胞培養

用含10%FBS的高糖DMEM培養液在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養細胞。細胞生長至滿皿的80%時進行傳代，棄培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次后，加入0.25%胰酶消化2～3 min，再加含血清培養液終止消化。用滴管輕輕吹打至細胞從皿底完全脫落，按試驗需求接種于培養板或培養瓶內待用。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

將H9c2細胞接種于96孔板中，調細胞密度為1.0×105～1.2×105個/ml，分為空白對照組、模型組、陽性對照組（10 μmol/L右丙亞胺）和葛根素低、中、高濃度組（10、50、100 μmol/L，按預試驗設計），每組5個復孔。除空白對照組不作任何處理外，其他各組細胞加入表柔比星（1.0 mmol/L）[4]，同時，加藥組細胞加入相應藥物，作用24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h。用酶標儀測定各孔細胞450 nm波長處的光密度（OD），計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝給藥組OD/空白對照組OD×100%。

2.3 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡形態

將H9c2細胞接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、給藥處理后，棄培養液，以PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌2次。加入5 mg/L的Hoechst 33258試劑，室溫輕搖30 min，經PBS洗滌后，用熒光顯微鏡在346 nm激發波長處觀察染色情況，并拍照。

2.4 AnnexinⅤ-FITC/PI染色檢測細胞凋亡率

將H9c2細胞接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、給藥處理后，棄培養液，以PBS洗滌2次，每孔加入0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸），于37℃消化2～3 min后，每孔加入含血清的培養液終止消化。細胞懸浮液以1 000 r/min（離心半徑為17.8 cm）離心10 min，棄上清，收集細胞后按照AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作進行染色。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）＝晚期細胞凋亡率+早期細胞凋亡率。

2.5 Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達

將H9c2細胞接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、給藥處理后，棄培養液，用預冷的PBS洗滌2次，加入細胞裂解液，4℃靜置30 min，12 000 r/min（離心半徑為9.8 cm）離心15 min。取上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。總蛋白經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，轉移到PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白室溫下封閉90 min，加入一抗[Bax（1∶5 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）]，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次后，加1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h后，再次洗膜，加入增強化學發光（ECL）液，曝光、顯影、定影。采用凝膠成像系統自帶軟件分析各組細胞凋亡相關蛋白條帶的灰度值，以其與內參β-actin灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.6 比色法檢測MDA含量和SOD活性

將H9c2細胞接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、給藥處理后，棄培養液，用PBS洗滌2次，每孔加入0.05 mmol/ml的乙二胺四乙酸和1 ml 0.1 mol/L的PBS，再加入50μl 1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-Ⅹ100），振蕩1 min。加入25%的H3PO4100μl，4℃下12 000 r/min（離心半徑為9.8 cm）離心1 h。取上清液，按檢測試劑盒說明書操作測定各組細胞MDA含量和SOD活性。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 細胞存活率

空白對照組、模型組、陽性對照組和葛根素低、中、高濃度組細胞存活率分別為100%、（58.3±0.11）%、（78.6±0.06）%、（61.2±0.08）%、（70.5±0.09）%、（76.4±0.12）%（n＝5）。與空白對照組比較，模型組細胞存活率降低（P＜0.05）。與模型組比較，葛根素中、高濃度組和陽性對照組細胞存活率均增加（P＜0.05）。與陽性對照組比較，葛根素低、中濃度組細胞存活率均降低（P＜0.05），葛根素高濃度組細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 細胞凋亡情況

模型組和葛根素低濃度組細胞出現較多亮藍色的凋亡小體；相比之下，葛根素中、高濃度組細胞的細胞核形態完整，熒光較暗，著色均勻，與陽性對照組細胞的染色狀況相近。各組細胞核的形態學觀察結果見圖1。

圖1 各組細胞核的形態學觀察結果（×200）Fig 1 Morphological results of cells in each group（×200）

3.3 細胞凋亡率

空白對照組、模型組、陽性對照組和葛根素低、中、高濃度組細胞凋亡率分別為（7.4±0.03）%、（43.2±0.07）%、（31.3± 0.06）%、（41.8±0.06）%、（38.5±0.05）%、（32.7±0.04）%（n＝5）。與空白對照組比較，模型組細胞凋亡率增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和葛根素中、高濃度組細胞凋亡率均降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，葛根素低、中濃度組細胞凋亡率均增加（P＜0.05）。各組細胞凋亡的流式細胞圖見圖2。

3.4 Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達

與空白對照組比較，模型組細胞Bcl-2蛋白表達減弱，Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達增強，Bax/Bcl-2增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和葛根素中、高濃度組細胞Bcl-2蛋白表達增強，Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達減弱，Bax/Bcl-2減小（P＜0.05）。各組細胞Bax、Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白表達的電泳圖見圖3，檢測結果見表1。

3.5 MDA含量和SOD活性

與空白對照組比較，模型組細胞MDA含量降低，SOD活性增強（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和葛根素中、高濃度組細胞MDA含量增加，SOD活性降低（P＜0.05）。各組細胞MDA含量和SOD活性的檢測結果見表2。

4 討論

圖2 各組細胞凋亡的流式細胞圖Fig 2 Flow cytometry of cells apoptosis in each group

圖3 各組細胞Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase-3蛋白表達的電泳圖Fig 3 Electrophoretograms of protein expression of Bax，Bcl-2 and Cleaved-caspase-3 of cells in each group

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

CCK-8檢測細胞存活率和流式細胞術檢測細胞凋亡率的實驗結果表明，葛根素的濃度在50～100 μmol/L時，在體外能有效抑制表柔比星引起的心肌細胞凋亡，提高細胞的存活率。Western blot結果顯示，葛根素抑制細胞凋亡的機制是增加Bcl-2的表達量從而減少Bax二聚體的形成，降低Bax/Bcl-2的比例[5]。Caspase-3是執行細胞凋亡的效應蛋白，當其裂解成活化片段（Cleaved-caspase-3）后，能夠連續傳遞和放大凋亡信號，從而導致細胞發生大量而快速的凋亡反應。實驗表明，在葛根素的干預下，Caspase-3裂解活化的程度減小，導致Cleaved-caspase-3的數量下降，從而抑制細胞的凋亡進程[6]。研究表明，Bax形成二聚體后能夠增加線粒體外模通透性，導致細胞色素C釋放，最終可誘導Caspase-3被裂解活化而啟動凋亡進程，因此推斷葛根素能夠抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑[7]。通過檢測SOD和脂質氧化反應產物MDA的水平，可以確定葛根素能夠降低過氧自由基的含量，有效抑制氧化應激對細胞的損傷，從而提高細胞的存活率[8]。

Tab 2 MDA content and SOD activity of cells in each group（±s，n＝5）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

右丙亞胺為乙二胺四乙酸的親脂性衍生物，能夠透過生物膜進入細胞并水解成類似EDTA的結構，通過絡合蒽環-鐵螯合物中的鐵離子，干擾鐵離子介導生成自由基，從而減輕過氧化反應對心肌的損害[9]。檢測心肌細胞存活率和凋亡率的結果顯示，100 μmol/L葛根素與10 μmol/L右丙亞胺在體外對心肌細胞的保護效果相近。Western blot的結果反映出右丙亞胺調控凋亡相關蛋白的能力優于葛根素，能更好地干預細胞信號通道抑制凋亡。而在檢測氧化應激指標方面，所得數據則顯示葛根素抑制細胞膜脂質氧化的能力強于右丙亞胺，這很可能歸功于葛根素4位和7位的2個酚羥基具有良好的還原性[10-11]。綜合而言，兩者保護細胞的機制相似而各有側重，在保護細胞的環節上存在互補的作用。

在臨床應用方面，盡管右丙亞胺已獲美國FDA批準錄入《美國腫瘤化療及放療保護劑臨床操作指南》，可見其療效廣受認可[12]，但副作用仍不可忽視，主要包括腎毒性和骨髓毒性，當用于兒童患者身上表現更為顯著[13]。葛根素不僅能夠抑制氧化應激對心肌的損傷，而且還具有保護血管內皮、擴張冠狀動脈、改善心肌血液循環等右丙亞胺所不具備的作用[14]。因此，在使用蒽環類藥物時，聯合應用葛根素與右丙亞胺可更有效地降低藥物的心肌毒性[15]。

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Puerarin on the Apoptosis of H9c2 Myocardial Cell Induced by Epirubicin

LI Cong1，ZHOU Jie2，HUANG Haichao3，WU Wei4，LI Yuan1（1.Dept.of Pharmacy，Guangdong Provincial People’s Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China；2.Dept.of Pharmacy，Tumor Prevention and Treatment Center，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060，China；3.Experimental Training Center，Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China；4.Dept.of Pharmacy，Guangdong Food and Drug Vocational-technical School，Guangzhou 510663，China）

OBJECTIVE：To study the effects of puerarin（Pue）on the apoptosis of H9c2 myocardial cell induced by epirubicin（Epi）.METHODS：The H9c2 myocardial cells were divided into blank control group，model group，positive control group（10 μmol/L dexrazoxane）and Pue low-dose，medium-dose and high-dose groups（10，50，100 μmol/L），with 5 wells in each group. Except blank control group didn’t received any treatment，other groups were treated with Epi（1.0 μmol/L）and relevant medicine. 24 h later，survival rate of myocardial cell was measured by CCK-8 kit；apoptotic morphology was observed by Hoechst 33258 fluorescent staining；apoptotic rate of myocardial cell was determined by flow cytometry；the protein expression of Bax，Bcl-2 and Cleaved-caspase-3 were assayed by Western blot；SOD activity and MDA content were assayed by colorimetric kit.RESULTS：Compared with blank control group，apoptotic body was obviously found in cell nucleus of model group；survival rate，the expression of Bcl-2 and SOD activity were decreased；while the apoptotic rate，the expression of Bax and Cleaved-caspase-3，Bax/Bcl-2 ratio and MDA content were increased.Compared with model group，the morphology of cell nucleus was complete in positive control group and Pue medium-dose and high-dose groups；survival rate，the expression of Bcl-2 and SOD activity were increased；while apoptotic rate，the expression of Bax and Cleaved-caspase-3，Bax/Bcl-2 ratio and MDA content were decreased，with statistical significance（P＜0.05）.There was no statistical significance in other indexes（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Pue could mitigate cardiac toxicity of Epi via inhibiting apoptotic signaling pathway and depressing oxidative damage.

Puerarin；Epirubicin；H9c2 myocardial cell；Cardiac toxicity

R361+.3；R932

A

1001-0408（2016）34-4807-04

2016-02-02

2016-04-17）

＊藥師。研究方向：藥劑學。電話：020-83827812。E-mail：583578431@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥劑學。電話：020-83827812。E-mail：389103928@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.17