microRNA-260在秀麗隱桿線蟲衰老進程中的作用研究

張照康， BILLY Kirunda John， 努爾古麗·蘇里坦， 楊利建

(華中師范大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 武漢 430079)

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microRNA-260在秀麗隱桿線蟲衰老進程中的作用研究

張照康， BILLY Kirunda John， 努爾古麗·蘇里坦， 楊利建*

(華中師范大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 武漢 430079)

本文以秀麗隱桿線蟲(C.elegans)為模式生物，通過測定microRNA-260(miR-260)編碼基因敲除后(Deletion)突變株與野生株(N2)線蟲壽命、生殖能力、進食能力和熱刺激條件下的生存能力，研究miR-260在衰老進程中發(fā)揮的作用.利用線蟲體內(nèi)衰老相關(guān)關(guān)鍵基因表達量的分析，探討miR-260干預(yù)衰老的可能分子機制.實驗結(jié)果顯示：miR-260突變株系相對于野生型線蟲壽命縮短，子代數(shù)目減少，進食能力的衰弱速度減慢，熱刺激條件下的生存條件能力降低.結(jié)論：miR-260敲除后總體上加快秀麗隱桿線蟲突變體衰老的進程.其可能的分子機理為，miR-260主要通過影響飲食限制通路和TOR信號通路中共同關(guān)鍵基因eat-2以及JNK信號通路中的jnk-1基因等的表達來調(diào)控線蟲的衰老進程.

秀麗隱桿線蟲; miR-260; 衰老;eat-2;jnk-1

衰老是生物體不可抗拒的自然規(guī)律，是有機體自我更新和修復(fù)能力減弱，結(jié)構(gòu)和功能退化，并最終走向死亡的過程，其特征表現(xiàn)在壓力刺激能力減退，平衡狀態(tài)打破和罹患疾病風(fēng)險增加[1].隨著全球人口老齡化，多種老年退行性疾病的高發(fā)以及隨之產(chǎn)生的巨大的醫(yī)療費用已成為越來越嚴重的社會問題.因此，探求健康的衰老模式，尋求簡便易行，經(jīng)濟有效，安全性高，并適宜推廣的干預(yù)衰老及治療衰老相關(guān)疾病的措施和方法具有重大意義.

秀麗隱桿線蟲(以下簡稱“線蟲”)是衰老研究的經(jīng)典模式生物[2-3].它具有實驗操作簡單、周期短、遺傳背景清晰等優(yōu)點，易于進行壽命實驗和作用機制的探索，被廣泛用于神經(jīng)行為學(xué)、衰老、sRNA、藥物篩選、環(huán)境科學(xué)和食品科學(xué)等相關(guān)方面的科學(xué)研究[4].其次，秀麗線蟲是獲得全基因組序列的生物，并且這些基因中40%以上的基因與人類基因同源，這為人們通過秀麗線蟲研究人類衰老的基因機理奠定了基礎(chǔ).再次，有研究表明線蟲信號通路中的關(guān)鍵基因的突變會極大的影響線蟲衰老的進程[2-5]. 例如，首個在線蟲中發(fā)現(xiàn)，多物種中保守的調(diào)控衰老的胰島素/IGF-1信號通路，其關(guān)鍵起始基因daf-2缺失的突變株線蟲壽命在20℃條件下延長達三倍之多[6-8].目前發(fā)現(xiàn)影響線蟲衰老的主要信號通路還包括雷帕霉素目標(biāo)信號通路(target of rapamycin， TOR)[9-13]、自噬通路、線粒體呼吸通路和缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1， HIF-1)通路等，生殖系統(tǒng)[14]和飲食限制[15-17]也會調(diào)控線蟲壽命，這些通路之間既相互聯(lián)系卻又各自在衰老進程中發(fā)揮不同的作用.

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小分子單鏈RNA，其大小長度約20～25個核苷酸[18，19].miRNA可以與靶mRNA通過堿基互補配對的方式結(jié)合，使得靶mRNA降解或者抑制靶mRNA的翻譯，從而調(diào)控靶mRNA的表達[18-21]. miRNA在胚胎發(fā)育、脂肪代謝、細胞增殖、凋亡、分化等一系列生理過程中都起到重要調(diào)控作用.miR-260作為線蟲體內(nèi)miRNA的一種，它對線蟲的衰老、生殖等生命過程的調(diào)控作用還未清楚.Burgt等[22]用生物信息學(xué)方法預(yù)測后生動物的miRNAs，他們指出miR-260沒有發(fā)卡結(jié)構(gòu)；Liu等[23]在討論山羊皮膚miRNAs保守性時提到了線蟲miR-260；但是，目前對線蟲miR-260功能方面的研究還是十分有限.

本文通過對miR-260敲除后突變株線蟲表觀特征的研究，探索miR-260在線蟲衰老、生殖等生命過程中的調(diào)控作用.在此基礎(chǔ)上進一步探討了miR-260調(diào)控衰老的分子機制，實驗中選取影響線蟲壽命的胰島素/IGF-1信號通路、生殖信號通路和TOR信號通路中直接關(guān)鍵基因daf-16，胰島素/IGF-1信號通路主要起始基因daf-2，JNK通路中的關(guān)鍵基因jnk-1，飲食限制及TOR信號通路共同關(guān)鍵基因eat-2等[2，6-17，24-29]共4個基因，在基因表達水平了解敲除miR-260對線蟲衰老進程的影響.

1材料與方法

1.1實驗材料

秀麗線蟲蟲株：野生株(N2)和miR-260突變株(miR-260)，由中國科學(xué)與技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院單革老師實驗室惠贈.(miR-260突變株：秀麗隱桿線蟲品系：MT14919;基因型：mir-260(n4601)Ⅱ；刪除斷點(Deletion breakpoints)：TTACTAAAAAAAAAGTGCCTAG/GATTGTCTGAA-AATT…CGGCTGAAAAATAT/AAATTTATA ACTGGGCAACAGAAA.摘自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)網(wǎng)頁)

菌株：E.coliOP50(大腸桿菌OP50)；線蟲食物，由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院吳政星老師實驗室惠贈.

1.2主要試劑

M9溶液(1 000 mL)：KH2PO4(3 g) ; Na2HPO4(6 g); NaCl(5 g); 高壓滅菌，再加入1M/L MgSO4(1 mL).

S-Buffer溶液(1 000 mL)： 0.05 M/L K2HPO4(129 mL)；0.05 M/L KH2PO4(871 mL)；NaCl(5.85 g)用固體配制，最后定容至1 L，高壓滅菌.

Bleach裂解液：5 M/L NaOH(1 mL)；10% NaClO(2 mL)；ddH2O(7 mL).

5-Fluoro-2’deoxyuridine (FUdR)配制：濃度為1 M/L，分子量246.2，用ddH2O配制，不滅菌，用無菌膜過濾.

NGM培養(yǎng)基(1 000 mL)：瓊脂粉(agar，17 g)；蛋白胨(peptone，2.5 g)；NaCl(3.0 g)；加水定容至1 L.高溫高壓滅菌后冷卻至60℃左右加入：1 M/L CaCl2(1 mL)； 1 M/L MgSO4(1 mL)；磷酸鉀緩沖液(pH=6，25 mL)；5 mg/mL膽固醇(1 mL)；制霉菌素(1 mL)；超凈臺內(nèi)快速倒入直徑3 cm或6 cm培養(yǎng)皿中，冷卻晾干，收起待用.

LB培養(yǎng)液(1 000 mL)：胰蛋白胨(Tryptone，10 g)；酵母提取物(Yeast extract，5 g)；NaCl(10 g)；定容至1 L，高溫高壓滅菌.

Trizol試劑購于 Invitrogen(英杰生命技術(shù)，美國)公司.反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 Thermo Fisher Scientific(賽默飛世爾科技，美國)公司.KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、K2HPO4·3H2O、NaOH、NaClO等試劑購于國藥集團.FUdR、膽固醇、制霉菌素購于阿拉丁試劑公司.蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物等試劑購于Thermo Fisher Oxoid(賽默飛世爾科技集團Oxoid公司，英國).

1.3主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超凈工作臺，購于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司(AIRTECH)；PCR儀，購于杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計，購于Thermo Fisher Scientific(賽默飛世爾科技，美國)公司；RT-PCR儀，購于BIO-RAD(伯樂生物科技 美國)公司.

1.4實驗方法

1.4.1線蟲的同步化 同步化是線蟲壽命、衰老相關(guān)實驗的關(guān)鍵步驟之一，是為了得到基本同時孵化或同時開始生長的健康活躍可用于實驗的線蟲的常用實驗手段.

同步化方法：將NGM培養(yǎng)基上多數(shù)線蟲培養(yǎng)至產(chǎn)卵期，用0.8 mL Bleach裂解液沖洗NGM培養(yǎng)基，將蟲子沖洗下來后，靜置3 min，震蕩，低速離心，盡可能的吸取上清液，再加入S-buffer溶液，震蕩，低速離心，盡可能的吸取上清.重復(fù)2次加入后加入0.8 mL S-buffer溶液放進入25℃生化恒溫箱中培養(yǎng)過夜.第二天離心，盡可能的吸取上清，將剩余部分混勻，均勻的打在NGM培養(yǎng)基上.待NGM培養(yǎng)基中的線蟲進入產(chǎn)卵期，將正處于產(chǎn)卵期的線蟲(母蟲)挑到NGM培養(yǎng)基上進行產(chǎn)卵.2～3 h后將線蟲(母蟲)挑走殺死后，將NGM培養(yǎng)基放進25℃的生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng).第二天觀察存活情況，發(fā)育至成蟲(L4期)后可用來進行壽命相關(guān)實驗.

1.4.2壽命測定實驗 25℃實驗溫度下，將同步化后發(fā)育至成蟲(L4期)的線蟲，挑至加有FUdR的NGM培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每24 h監(jiān)測一次線蟲的存活情況并將死亡線蟲挑出直至全部死亡.線蟲死亡判定：以用挑線蟲的鉑金絲觸碰線蟲頭部兩次，線蟲無刺激反應(yīng)為死亡判定標(biāo)準(zhǔn).

1.4.3線蟲后代數(shù)目測定實驗 25℃實驗溫度下，將同步化后發(fā)育至L3階段的一條線蟲(產(chǎn)卵之前)，挑至NGM培養(yǎng)基.每隔24 h觀察一次，若已有孵化子代線蟲則需將母蟲轉(zhuǎn)移至新的NGM培養(yǎng)基上，在子代線蟲生長至成蟲前挑出殺死并進行計數(shù)，直至沒有子代幼蟲產(chǎn)生.

1.4.4線蟲的熱刺激條件下生存能力的測定實驗 25℃實驗溫度下，將同步化后發(fā)育至成蟲(L4期)的線蟲，挑至加有FUdR的NGM培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)5～10 d，去除死亡蟲子將培養(yǎng)基放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 h監(jiān)測一次線蟲的生存情況，直至全部死亡.

1.4.5線蟲進食能力的測定實驗 25℃實驗溫度下，將同步化后發(fā)育至成蟲(L4期)的線蟲，挑至滴有食物的NGM培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，一條蟲子一個板.5 d后開始每隔24 h監(jiān)測一次蟲子的咽部跳動次數(shù)(以記錄的第一天為起始第一天)，用秒表記錄十秒內(nèi)的咽部跳動次數(shù)，記錄3次以上，去除異常值后取平均，直至跳動次數(shù)低于150次/分，即認為進入了慢速吞咽期.

1.5miR-260分子機制的研究

1.5.1線蟲總RNA的提取及cDNA的合成 25℃實驗溫度下，將同步化后發(fā)育至成蟲(L4期)的線蟲培養(yǎng)4 d，用M9緩沖液將線蟲洗下來，離心，盡去上清，加入Trizol試劑提取總RNA.按照Trizol提取RNA的步驟分別提取N2株系和miR-260株系的總RNA.將提取的總RNA進行凝膠電泳鑒定，并對總RNA濃度，純度進行測定，未發(fā)生降解的總RNA方可進行下一步實驗.按照Thermo Scientific反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行cDNA的合成.

1.5.2qPCR鑒定關(guān)鍵基因表達量 分別以N2株系和miR-260株系線蟲合成的cDNA為模板，act-1為內(nèi)參基因，進行qPCR測定兩株系各個關(guān)鍵基因之間相對表達量的差異.尋找miR-260突變株在基因表達層次與野生型N2的差異，以便從基因表達水平了解miR-260是通過哪些信號通路來影響衰老進程的.

1.6數(shù)據(jù)分析與處理

使用軟件Origin，Excel實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，采用平均值假設(shè)檢驗分析，其中*代表P<0.05為顯著性差異，**代表P<0.01為極顯著性差異.

2結(jié)果與討論

2.1線蟲衰老特征實驗結(jié)果

2.1.1敲除miR-260對線蟲壽命的影響 壽命長度是衡量衰老的重要指標(biāo)之一.實驗結(jié)果(表1和圖1)表明，miR-260突變株(miR-260)組線蟲平均壽命顯著低于對照組野生株(N2)組線蟲(P<0.05).其中對照組野生株(N2) 組線蟲平均壽命為14.51±0.94 d，最長壽命為19.67±0.47 d；miR-260突變株組線蟲平均壽命為12.62±0.94 d，最長壽命為19.33±1.25 d，分別縮短了13.04%和1.69%.

表1 野生型(N2)與miR-260突變株的平均壽命

注：*為P<0.05.

圖1 N2與miR-260突變株線蟲的壽命對比Fig.1 Lifespan of N2 and miR-260

2.1.2敲除miR-260對線蟲生殖能力的影響 產(chǎn)卵量是生殖能力的直接體現(xiàn)，線蟲在性成熟后第2 d和第3 d進入生殖高峰期，本實驗測得miR-260突變株組線蟲平均子代數(shù)目明顯低于對照組野生株(N2)組線蟲，如圖2所示.其中對照組野生株(N2)組線蟲平均子代數(shù)目為118.37±17.21，而miR-260突變株組平均子代數(shù)目為89.95±24.46， 減少了24.01%.miR-260突變株的生殖能力顯著下降.

2.1.3敲除miR-260對線蟲的熱刺激條件下生存能力的影響 對環(huán)境的適應(yīng)能力是反應(yīng)衰老進程的指標(biāo)之一.實驗結(jié)果(圖3)表明，miR-260突變株組線蟲的熱刺激條件下的適應(yīng)能力的各項指標(biāo)都低于對照組野生株(N2)組線蟲.其中第5 d熱刺激條件下對照組野生株(N2)組線蟲平均存活時間為10.58±0.39 h，最長存活時間為18.00 h； miR-260突變株線蟲平均存活時間為8.85±0.73 h，最長存活時間為16±2 h，分別縮短了18.90%和11.11%， miR-260突變株平均存活時間明顯低于野生株(N2)組.第10 d熱刺激條件下對照組野生株(N2)組線蟲平均存活時間為8.31±0.75 h，最長存活時間為14.40±1.44 h；miR-260突變組線蟲平均存活時間為7.99±0.53 h，最長存活時間為13.80±2.16 h，分別縮短了3.85%和4.17%.

圖2 N2與miR-260突變株線蟲的子代數(shù)目Fig.2 Brood size of N2 and miR-260

圖3 N2與miR-260突變株線蟲的熱刺激條件下生存能力測試Fig.3 The survival of the N2 and miR-260 in the heat stress

2.1.4敲除miR-260對線蟲進食能力的影響 隨著線蟲的不斷衰老，其進食能力下降，吞咽速度減慢.因此，線蟲吞咽速率也是其衰老標(biāo)志之一，我們對比了兩組線蟲進入慢速吞咽期的時間.實驗結(jié)果(圖4)表明，miR-260突變株組線蟲進入慢速吞咽期的時間略晚于野生株(N2)組線蟲.其中對照組野生株(N2)組線蟲進入慢速吞咽期的時間為6.00±0.20 d，而miR-260突變株組線蟲進入慢速吞咽期的時間為6.70±0.81 d，延長了11.67%.miR-260突變株秀麗線蟲的進食能力顯著增強.

圖4 N2與miR-260突變株的進入慢速吞咽期平均時間Fig.4 Average time for the occurrence of slow pharyngeal pumping rate of N2 and miR-260 C. elegans

2.2分子機制的探究結(jié)果

2.2.1引物序列 實驗以act-1為內(nèi)參基因，選擇衰老相關(guān)關(guān)鍵基因daf-2、daf-16、jnk-1、eat-2為代表基因，在mRNA表達水平探究敲除miR-260對線蟲衰老進程的影響，其引物序列如表2.

表2 qPCR引物序列

2.2.2敲除miR-260對線蟲衰老進程中關(guān)鍵基因表達的影響 利用實時熒光定量PCR對衰老相關(guān)關(guān)鍵基因daf-2、daf-16、jnk-1、eat-2相對表達量進行監(jiān)測，以野生株N2表達量為control，act-1為內(nèi)參基因.實驗結(jié)果表明(圖5)：miR-260突變株線蟲組的daf-2、daf-16、jnk-1、eat-2的表達量分別是野生株N2線蟲組的1.199±0.117，0.770±0.018，0.638±0.031和3.097±0.264倍.可見，敲除miR-260基因?qū)λダ详P(guān)鍵基因的表達產(chǎn)生不同程度的影響，daf-2和eat-2表達量增加，其中eat-2表達量上調(diào)至三倍之多，有極顯著性差異；daf-16和jnk-1表達量減少，其中jnk-1表達量的降低具有顯著性差異.

圖5 miR-260突變株線蟲的關(guān)鍵基因相對野生型N2表達水平Fig.5 The expression level of key genes in miR-260 deleted C.elegans compared with N2 C.elegans

3結(jié)論與討論

本文探索了miR-260突變株線蟲壽命、衰老的相關(guān)特征及其影響衰老的相關(guān)分子機制.實驗結(jié)果表明：與野生株(N2)線蟲相比，平均壽命明顯縮短，生殖能力、熱刺激條件下的適應(yīng)能力都顯著下降，但進食能力卻有一定的提高.其可能的分子機理是mir-260的敲除通過影響基因jnk-1、eat-2進而調(diào)控線蟲的衰老進程.jnk-1為JNK通路中的關(guān)鍵基因，而JNK為線蟲體內(nèi)唯一的編碼絲氨酸/絲氨酸激酶的刺激活化蛋白激酶，其主要在運動能力、成蟲壽命、熱刺激及氧化刺激等方面發(fā)揮重要作用.jnk-1表達量的提高能延長線蟲壽命，提高熱刺激和氧化刺激抵抗能力[24-25].eat-2作為飲食限制及TOR信號通路共同關(guān)鍵起始基因，在線蟲進食能力和壽命調(diào)控中發(fā)揮著不可或缺的作用，eat-2的表達水平降低，會降低其進食能力并延長線蟲壽命[26].mir-260的敲除造成eat-2表達量增加(**極顯著性差異)，jnk-1表達量減少(*顯著性差異)，線蟲壽命縮短，繁殖能力下降，刺激能力降低，進食能力增強，基因表達方面結(jié)果與表觀結(jié)果較為符合.即可認為miR-260通過影響基因jnk-1、eat-2進而調(diào)控線蟲的衰老進程.

另外，daf-2、daf-16表達量也具有一定變化，且與表觀結(jié)果一致.其中daf-2為胰島素/IGF-1信號通路主要起始基因，降低daf-2的表達水平能夠延長線蟲壽命3倍之多.daf-2基因的突變還使得線蟲健康生活的時間增加，極大地延緩線蟲衰老進程[7，27].daf-16為胰島素/IGF-1信號通路、生殖信號通路和TOR信號通路中最終直接影響壽命的關(guān)鍵基因，daf-16表達的增加能延緩線蟲的衰老進程，增加線蟲壽命和生殖能力[17，28-29].

目前已發(fā)現(xiàn)影響線蟲壽命的miRNAs并不是很多，lin-4， miR-34，miR-80，miR-228，miR-239功能的缺失會增加線蟲壽命，而let-7，miR-71和miR-84/miR-241的突變會使線蟲壽命縮短.這些miRNAs是通過與靶 mRNA堿基互補配對方式結(jié)合，使得靶mRNA降解或者抑制靶mRNA的翻譯，從而調(diào)控靶mRNA的表達并影響壽命.例如，lin-4的靶基因是lin-14，lin-14通過影響胰島素信號通路的daf-16和hsf-1的表達來調(diào)控線蟲壽命. miR-260作為細胞內(nèi)具有調(diào)控作用miRNAs中的一員，它的敲除極大的影響了線蟲的壽命，改變了衰老進程中的關(guān)鍵基因的表達，但其具體的作用機制以及相關(guān)的靶基因尚待進一步探究.

致謝 該工作得到國家自然科學(xué)基金面上項目、華中師范大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費和創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項目基金支持，感謝這些基金的支持.該工作是在課題組賈亞老師和楊利建老師的指導(dǎo)下完成的，感謝兩位老師的悉心指導(dǎo)及課題組成員所提供的幫助.

感謝中國科學(xué)與技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院單革老師實驗室贈予線蟲蟲株，感謝華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院吳政星老師實驗室贈予E.coli OP50，感謝武漢輕工大學(xué)宮智勇老師實驗室及華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院公共實驗平臺提供的RT-PCR儀.

[1] FLAAT T. A new definition of aging？[J].Frontiers in Genetics， 2012， 3(3):148.

[2] KENYON C J. The genetics of ageing[J].Nature， 2010， 464(7288):504-512．

[3] TISSENBAUM H A. Special issue on genetics and aging: genetics， life span， health span， and the aging process in caenorhabditis elegans[J].Journals of Gerontology， 2012， 67(5):503-510．

[4] KLAPPER M， EHMKE M， PLGUNOW D， et al. Fluorescence based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches[J].Journal of Lipid Research， 2011， 52(6):1281-1293．

[5] TURNHEIM K. When drug therapy gets old:Pharmacokinetics and pharmacodynamics in the elderly[J].Experimental Gerontology， 2003， 38(8):843-853．

[6] KENYON C. The plasticity of aging: insights from long-lived mutants[J].Cell， 2005， 120(4):449-460．

[7] HERNDON L A， SCHMEISSNER P J， DUDARONEK J M， et al. Stochastic and genetic factors influence tissue specific decline in ageing C. elegans[J].Nature，2002， 419(6909):808-814．

[8] TULLET J M A， HERTWECK M， AN J H， et al. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans[J].Cell， 2008， 132(6):1025-1038．

[9] KAEBERLEIN M， WILSON POWERS R， STEFFEN K K， et al Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients[J].Science， 2005， 310(5751):1193-1196．

[10] KAPAHI P， ZID B M， HARPER T， et al. Regulation of lifespan in Drosophila by modulation of genes in the TOR signaling pathway[J].Current Biology， 2004， 14(10):885-890.

[11] JIA K， CHEN D， RIDDLE D L. The TOR pathway interacts with the insulin signaling pathway to regulateC.eleganslarval development， metabolism and life span[J]. Development， 2004， 131(16):3897-3906．

[12] VELLAI T， TAKACS-VELLAI K， ZHANG Y. Genetics: influence of TOR kinase on lifespan inC.elegans[J].Nature， 2003， 426(6967):620.

[13] HARRISON D E， STRONG R， SHARPET Z D， et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically Heterogeneous mice[J]. Nature， 2009， 460(7253):392-395．

[14] LAPIERRE L R， HANSEN M. Lessons fromC.elegans: signaling pathways for longevity Endocrinology and Metabolism[J].Trends in Endocrinology & Metabolism， 2012， 23(12):637-644．

[15] LIBERT S， ZWIENER J， CHU X， et al. Regulation of Drosophila life span by olfaction and food-derived odors[J].Science， 2007， 315(5815):1133-1137．

[16] APFELD J， O’CONNOR G， MCDONAGH T， et al. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin like signals to lifespan inC.elegans[J]. Genes & Development， 2004， 18(24):3004-3009．

[17] LAKOWSKI B， HEKIMI S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 1998， 95(22):13091-13096．

[18] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics， biogenesis， mechanism， and function[J].Cell， 2004，116(2):281-297．

[19] AMBROS V，BARTEL B，BARTEK D P， et al. A uniform system for microRNA annotation[J].RNA， 2003， 9(3):277-279．

[20] HUMPHREYS D T， WESTMAN B J， MARTIN D I， et al. MicroRNAs control translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2005， 102(47):16961-16966．

[21] JING Q， HUANG S， GUTH S， et al. Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated mRNA instability[J].Cell， 2005， 120(5):623-634．

[22] BURGT A V D， FIERS M W， NAP J P， et al. In silico miRNA prediction in metazoan genomes: balancing between sensitivity and specificity[J].BMC Genomics， 2009， 10(1):1-24．

[23] LIU Z， XIAO H， LI H， et al. Identification of conserved and novel microRNAs in cashmere goat skin by deep sequencing[J/OL].PLoS ONE， 2012， 7(12)，e50001[2012-12-07].http://journals.plos.org/plosone/article/file?id=10.1371/journal.pone.0050001&type=printable. doi:10.1371/journal.pone.0050001．

[24] SEUNG WOOK O， ARNAB M， NENAD S， et al. JNK regulates lifespan inCaenorhabditiselegansby modulating nuclear translocation of fork head transcription factor/DAF-16[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2005， 102(12):4494-4499．

[25] KAWASAKI M， HISAMOTO N， IINO Y， et al. A Caenorhabditis elegans JNK signal transduction pathway regulates coordinated movement via type-D GABAergic motor neurons[J].EMBO Journal， 1999， 18(13):3604-3615．

[26] ARANTES-OLIVEIR N， BERMAN J R， KRNYON C， et al. Healthy animals with extreme longevity[J].Science， 2003， 302(5645):611.

[27] GARIGN D， HSU A L， FRASER A G， et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat shock factor and bacterial proliferation[J].Genetics， 2002， 161(3):1101-1112．

[28] GREER E L， DOWLATSHAHI D， BANKO M R， et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C.elegans[J].Current Biology， 2007， 17(19):1646-1656．

[29] HONJOH S，YAMAMOTO T，UNO M， et al. Signalling through HEB-1 mediates intermittent fasting-induced longevity inC.elegans[J].Nature， 2009， 457(7230):726-730．

The role of miR-260 in the ageing process ofC.elegansand its molecular mechanism

ZHANG Zhaokang, BILLY Kirunda John, NURGUL Sultan, YANG Lijian

(College of Physical Science and Technology, Central China Normal University, Wuhan 430079)

By usingCaenorhabditiselegans(C.elegans) as a model animal, the effect of deletion of miR-260 coding gene inC.eleganswas studied on lifespan, fertility, ability to eat and the ability to survive under the heat stress. In order to have better understanding on the mechanisms of how miR-260 regulate lifespan, the expression level of key genes in main aging pathways were investigated. The results showed that: miR-260 deletion strains have a shortened lifespan, reduced brood size, increased time attaining the low feed rate and decreased ability to survive under the heat stress, which speeding up the aging process. Its possible molecular mechanism is that deletion of miR-260 influenced the expression ofeat-2 andjnk-1, and regulated the aging process through dietary restriction pathway, TOR signaling pathway and JNK signaling pathway.

Caenorhabditiselegans; miR-260; aging;eat-2;jnk-1

2016-09-02.

國家自然科學(xué)基金項目(11175068，11474117)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費項目(CCNU2015A05045)；華中師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目.

1000-1190(2016)06-0897-07

Q291

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: lijian_yang@phy.ccnu.edu.cn.