GC-TEA測定化妝品中的NDELA*

邢昆明，劉 華，王貽坤，朱 靈，劉 勇，王 安，計 敏

(1 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院應(yīng)用技術(shù)研究所，安徽 合肥 230031；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；3 合肥市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽 合肥 238000；4 安徽易康達光電科技有限公司，安徽 合肥 230031)

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GC-TEA測定化妝品中的NDELA*

邢昆明1,2，劉 華3，王貽坤1,4，朱 靈1，劉 勇1，王 安1，計 敏1,4

(1 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院應(yīng)用技術(shù)研究所，安徽 合肥 230031；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；3 合肥市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽 合肥 238000；4 安徽易康達光電科技有限公司，安徽 合肥 230031)

建立了化妝品中N-亞硝基二乙醇胺的氣相色譜-熱能分析儀聯(lián)用分析測定方法。化妝品以水為溶劑進行超聲提取，經(jīng)高速冷凍離心后，上清液用純氮吹干，殘渣經(jīng)混合溶劑溶解，再經(jīng)凈化等處理后，通過微孔濾膜過濾到色譜瓶進樣檢測。樣品經(jīng)DB-624(30 m×0.25 mm，1.4 μm)石英毛細管色譜柱分離后進入亞硝胺檢測器進行定性和定量檢測。NDELA的方法定量限為20 μg/kg，回收率為87%～105%。有部分化妝品檢出NDELA陽性，最高濃度達48 μg/kg。本方法能夠滿足化妝品中NDELA的測定要求。

氣相色譜-熱能分析儀；化妝品；N-亞硝基二乙醇胺

化妝品作為日常用品，會長時間駐留在皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇等部位，其安全性備受關(guān)注。亞硝基化合物是一類強烈的化學(xué)致癌物質(zhì)，能誘發(fā)多種動物的惡性腫瘤[1]。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)的分類，N-亞硝基二乙醇胺歸類于可能對人體致癌[2]。我國在《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中已明確將亞硝胺列為化妝品中的禁用組分[3]。N-亞硝基二乙醇胺(NDELA)是一種黃色粘稠的油狀液體，屬于不揮發(fā)性亞硝胺。大多數(shù)化妝品含有二乙醇胺和三乙醇胺，這兩種通常能夠生成NDELA[4]。由于化妝品原料中含氮物質(zhì)種類繁多，加上近年來分析方法的改進，在化妝品中檢測到的亞硝胺化合物也很多。在這些種類中尤以NDELA的檢出率最高，在多種防曬、護膚、清潔用品中都有檢出的報道，而且含量很高[4]。

為了分析的目的，亞硝胺通常分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性亞硝胺，非揮發(fā)性亞硝胺更加經(jīng)常出現(xiàn)在化妝品及其原料中[1]。在NDELA的研究中最頻繁的是使用氣相色譜或液相色譜與熱能分析儀聯(lián)用法[4-8]。Thermal Energy Analyser是亞硝胺專用檢測器，在絕大多數(shù)化妝品中都會有基質(zhì)的干擾，因此，只有特殊的檢測器例如TEA才能得到普遍的應(yīng)用[1]，具有測量靈敏度高、檢出限低、時間響應(yīng)快、線性范圍大等優(yōu)點，是目前公認的最為準(zhǔn)確和便利的檢測手段[9-10]。Ducos P利用GC-TEA法測定了尿液中的NDELA，檢測限為0.3 μg/L[7]。Vidira E R利用GC-TEA法檢測了橡膠奶頭中的NDELA，方法定量限為3 μg/kg[5]。

另外，對亞硝胺檢測的方法還有氣相色譜或液相色譜-質(zhì)譜法[11-14]、毛細管電泳色譜法[15]氣相色譜電導(dǎo)法[16]等。

表1 氣相色譜或液相色譜與各種檢測器聯(lián)用測定亞硝胺的檢測限和應(yīng)用領(lǐng)域[1,18-26]

注：GC，氣相色譜；HPLC，液相色譜；MS，質(zhì)譜；TEA，熱能分析儀；FID，火焰離子化檢測器；AFID，堿性火焰離子化檢測器；NPD，氮磷檢測器；ECD，電子捕獲檢測器；CECD，庫爾森電導(dǎo)檢測器；HECD，霍爾電導(dǎo)檢測器；PID，光致化學(xué)檢測器；UV/VIS，紫外可見檢測器；PD，極譜檢測器；PCD，光電導(dǎo)檢測器；EC，電化學(xué)檢測器；FD，熒光檢測器。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

安捷倫7890A氣相色譜儀，配置安捷倫G4513A自動進樣器，美國安捷倫公司；熱能分析儀，CND100B型亞硝胺檢測器，安徽易康達光電科技有限公司；HR/T16M臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；KQ-100DB型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；DC-12型氮吹儀，上海安譜儀器有限公司；GHP雙性濾膜，美國Pall公司；FRP-24直連高速旋片式真空泵，北京北儀優(yōu)成真空技術(shù)有限公司；離心管等。

NDELA標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國chemservice和德國DR；NDELA標(biāo)準(zhǔn)品純品，德國DR。水，超純水；二氯甲烷，色譜級，阿拉丁試劑；甲醇，優(yōu)級純，滬試；氨基磺酸胺、正丁醇，分析純，天津光復(fù)試劑研究所；氯仿、丙酮、無水硫酸鈉，分析純，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。柱層層析硅膠，青島海洋化工廠；堿性氧化鋁，柱層析用FCP 200～300目，滬試；氮氣為高純氮；Agilent 和Supelco等品牌玻璃棉，農(nóng)殘級。層析硅膠、堿性氧化鋁和無水硫酸鈉在110 ℃下烘干活化10 h后于干燥器中保存。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：利用電子天平稱取NDELA標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇，超聲10 min幫助溶解，-20 ℃下避光保存，保質(zhì)期3個月；標(biāo)準(zhǔn)測試溶液用甲醇稀釋儲備液，-20 ℃下保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

硅膠柱制作：稱取3 g活化后的硅膠干法裝填于玻璃層析柱中，玻璃棒敲實，加入5 g無水硫酸鈉，敲實。氧化鋁柱制作：稱取5 g堿性氧化鋁，濕法裝柱，頂層填裝無水硫酸鈉。

1.2 氣相色譜儀和熱能分析儀檢測條件

GC-TEA檢測條件見表2。

表2 GC-TEA檢測條件

1.3 樣品處理

化妝品樣品均購買于本地大型超市。稱取5 g水溶性或脂溶性化妝品于50 mL具塞錐形瓶中，加入氨基磺酸胺0.5 g和氯化鈉1 g，加入超純水5 mL和三氯甲烷4 mL，室溫下超聲提取30 min后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，在4 ℃下12000 r/min冷凍離心15 min，用5 mL移液管移取5 mL上清液到試管中，放置于氮吹儀上氮氣吹干，殘渣用5 mL三氯甲烷和丙酮(體積比5:1)混合溶液溶解，過硅膠層析柱。用10 mL三氯甲烷和丙酮(體積比5:1)溶液淋洗，10 mL丙酮洗脫，收集洗脫液于試管中，氮氣吹干，移液器移取1 mL甲醇溶解殘渣，0.20 μm微孔濾膜過濾于2 mL色譜瓶中，在-20 ℃下避光保存待進樣。樣品前處理流程圖見圖1。

圖1 樣品前處理流程

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法定量限

分別配制50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、10000 ng/mL的NDELA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述儀器實驗條件下進行測定，以峰面積對濃度作圖得到線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。以5倍信噪比作為定量限，則可得儀器對NDELA的定量限和NDELA的方法定量限。結(jié)果表明，儀器檢測NDELA線性非常好，線性系數(shù)更是達到了0.9999，方法定量限較低。另外，配制低濃度的NDELA標(biāo)準(zhǔn)溶液時，應(yīng)特別注意移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，防止產(chǎn)生較大體積相對誤差，影響檢測的結(jié)果。

表3 NDELA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 樣品提取方法的選擇

針對水溶性和脂溶性化妝品樣品的物化性質(zhì)，以及NDELA由于兩個羥基官能團而具有很強的極性，選擇利用不同的溶劑(水、甲醇、二氯甲烷、水和氯仿)進行提取。各種提取方法的特點見表4。結(jié)果表明加入三氯甲烷可以使脂溶性化妝品的難溶物質(zhì)溶解而使得提取效率提高，使得水和三氯甲烷混合體系的提取效果最好，操作簡便易行，繼而建立了同時適合水溶性和脂溶性樣品的前處理方法。

表4 添加不同溶劑提取NDELA特點

化妝品中亞硝胺的提取方法較多，例如微波、超聲、加熱和振蕩等，利用超聲可以簡化實驗的步驟，降低實驗的難度，所需儀器液相對簡單便宜，并且提取效率也較高[17]。化妝品中亞硝胺的種類繁多，含量低，化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)多樣，而且在分析過程中有可能生成新的亞硝胺，出現(xiàn)假陽性干擾，影響測定結(jié)果的可靠性[1,13]。添加氨基磺酸胺作為亞硝基化抑制劑，可以抑制實驗過程中的亞硝基化反應(yīng)，避免亞硝胺形成，增加結(jié)果的準(zhǔn)確度。加入氯化鈉可以增大物質(zhì)在水中的溶解度，從而提高提取效率。

2.3 固相萃取條件的選擇

考察了Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)、硅藻土液液萃取、硅膠柱和氧化鋁柱的凈化效果。Oasis HLB固相萃取柱由于其價格昂貴而且需要全自動固相萃取儀配合進行操作，檢測成本較高。硅藻土液液萃取耗時較長，且滿足要求的硅藻土材料價格昂貴。氧化鋁柱消耗淋洗和洗脫溶液的體積較大。結(jié)果表明，硅膠柱凈化后雜質(zhì)峰較少出現(xiàn)，效果較好，而且操作方便。淋洗溶液嘗試6 mL、10 mL和14 mL，洗脫溶液嘗試了6 mL、10 mL和14 mL，進行正交試驗，結(jié)果表明10 mL淋洗和10 mL洗脫效果最好，回收率最高。

表5 固相萃取結(jié)果

樣品經(jīng)過固相萃取凈化前后色譜圖見圖2。可見，色譜圖基線平穩(wěn)，無基質(zhì)效應(yīng)，主要是因為亞硝胺檢測器的特征性響應(yīng)，對于多數(shù)雜質(zhì)沒有信號；色譜峰左右對稱，峰形好，說明色譜柱對分離化妝品中雜質(zhì)和NDELA有著良好的效果；萃取凈化除去了一些小的雜質(zhì)峰，但是對于NDELA的測定影響不大。但是考慮到化妝品中還有很多成分，過多的雜質(zhì)會堵塞色譜儀的進樣口，污染襯管和毛細管色譜柱從而降低其使用壽命，對濾芯和檢測器也有不利，這些原因可能會影響檢測的穩(wěn)定性，所以對樣品進行固相萃取過柱是非常必要的。

圖2 固相萃取前(a)和萃取后(b)的色譜圖

2.4 儀器條件的優(yōu)化

2.4.1 氣相色譜儀

根據(jù)亞硝胺的物化特性，氣相色譜儀選擇了DB-624、HP-5和HP-50+等中等極性毛細管色譜柱，結(jié)果HP-50+在色譜允許的溫度范圍內(nèi)不出峰，原因可能為色譜柱保留了NDELA；HP-5峰形不好，表現(xiàn)為嚴重的后拖尾；如圖3所示，DB-624峰形和大小均較好，選擇用作實驗。

圖3 HP-5(a)和DB-624(b)分離NDELA色譜圖

進樣口溫度設(shè)定為250 ℃，以便能更好的汽化NEDLA；柱箱溫度為采用程序升溫的方式，使得NDELA峰形較好，無雜質(zhì)峰與主峰同時出現(xiàn)。另外還應(yīng)注意，在更換進樣口襯管時，如果帶有玻璃棉，必須要大濃度進樣先予以飽和，否則玻璃棉會吸附NDELA，造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確和不穩(wěn)定。測試了不同品牌包括新襯管中的玻璃棉，都會對NDELA有不同程度的吸附而導(dǎo)致色譜峰變小。

2.4.2 熱能分析儀

根據(jù)TEA儀器生產(chǎn)廠家對于所測亞硝胺檢測建議的最佳條件，設(shè)置熱能分析儀各種參數(shù)。

2.5 樣品的測定

對膏霜、水劑、香波等不同類型的二十種樣品采用上述前處理和測定方法進行了NDELA的測定，結(jié)果表明其中有部分樣品呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，最高濃度達48 μg/kg，結(jié)果見表6。

表6 樣品中NDELA測定結(jié)果

2.6 方法的回收率和精密度

部分化妝品經(jīng)過儀器測定不含有NEDLA。向這些化妝品中添加三種不同濃度100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL內(nèi)標(biāo)，按照上述的樣品前處理方法以及實驗條件測定并計算方法的回收率和精密度。結(jié)果回收率87%～105%。對同一個化妝品添加相同濃度500 ng/mL的標(biāo)樣(n=6)，計算精密度RSD小于5%。

3 結(jié) 論

利用水和氯仿混溶體系，對化妝品中的NDELA進行萃取，利用硅膠層析柱進行凈化，采用氣相色譜-熱能分析儀聯(lián)用方法對NEDLA進行定性和定量檢測。利用本方法不需區(qū)分水溶性和脂溶性化妝品，均可以檢測結(jié)果，避免了有些化妝品難以區(qū)分類別帶來的麻煩。優(yōu)化了前處理萃取和凈化方法以及儀器的使用條件，該法方法檢測限低，回收率高，精密度好。檢出部分樣品含有NDELA，表明化妝品中的NDELA的質(zhì)量控制還有待于進一步加強。亞硝胺檢測器專屬性強，色譜圖中雜質(zhì)少，基線平緩，定量準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，可以用作化妝品中NDELA的常規(guī)檢測。

[1] Ikeda K, Migliorese K G. Analysis of nitrosamines in cosmetics[J]. Soc. Cosmet. Chem., 1900,41:283-333.

[2] IARC. Agents Classified by the IARC Monographs, Volumes 1-108[Z].2013.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范[Z]. 2007.

[4] 杜業(yè)剛,林少彬,朱英.化妝品中亞硝胺的研究[J].衛(wèi)生研究，2004,3(33):379-380.

[5] Vidira E R，Pierozan N J，Livison V.Determination of N-nitrosamines and N-nitrosables Substances in Rubber Teats and Sothers by GC-TEA[J].Brazilian Archives of Biology and Technology,2006,49:73-77.

[6] 國家技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 5009.26-2003食品中N-亞硝胺類的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社:2003.

[7] Ducos P, Gaudin R, Francin J M. Determination of N-nitrosodiethanolamine in urine by gas chromatography thermal energy analysis: application in workers exposed to aqueous metalworking fuids[J]. Int Arch Occup Environ Health,1999,72:215-222.

[8] 國家技術(shù)監(jiān)督局.GB/T23228-2008 卷煙主流煙氣總粒相物中煙草特有N-亞硝胺的測定 氣相色譜-熱能分析聯(lián)用法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社:2008.

[9] 方杰,計敏,孫淼,等.亞硝胺化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的研制[J].光譜實驗室,2011,28(4):1583-1587.

[10]劉勇,馬新建,計敏,等.亞硝胺化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)氣體流量控制器設(shè)計[J].自動化與儀表,2012(7):16-19.

[11]馬強,王超,白樺,等.同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中的N-亞硝基二乙醇胺[J].色譜,2009,27(3):283-287.

[12]王峰,耿寧,徐春祥,等.HPLC-MS/MS測定化妝品中的NDELA[J].香料香精化妝品,2010(2):28-32.

[13]林業(yè)剛,丁昌明,林少彬. N-亞硝基二乙醇胺液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[J].中國公共衛(wèi)生, 2006,22(12):1533-1534.

[14]BS EN 12868:1999 Child use and care articles-Methods for determining the release of N-Nitrosamines and N-Nitrosatable substances from elastomer or rubber teats and soothers[S].

[15]Matyska M T, Pesek J J, Yang L. Screening method for determining the presence of N-Nitrosodiethanolamine in cosmetics by open-tubular capillary electrochromatography[J].J Chromatogr A,2000,887:497-503.

[16]Collier S W, Milstein S R, Orth D S. Quantitative assay of volatile and non-volatile N-nitrosanines by gas chromatography with an electrolytic conductivity detector.I.Method development and assay of N-nitrosodiethanolamine(NDELA) in creams and lotions[J]. J. Soc.Cosmet Cbem., 1988,39:329-346.

[17]馬強,席海為,王超,等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中的10種揮發(fā)性亞硝胺[J].分析化學(xué),2011,39(8):1201-1207.

[18]Wei X, Hongwei H, xingyi J, et al. Simultaneous determination of four tobacco-specific N-nitrosamines in mainstream smoke for Chinese Virginia cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and validation under ISO and“Canadian intense” machine smoking regimes[J]. Analytica Chimica Acta, 2010,674:71-78.

[19]Anna V, Rimma S, Ovadia L, et al. GC determination of N-nitrosamines by supersonic molecular beam MS equipped with triple quadrupole analyzer, GC/SMB/QQQ/MS[J]. Analytica Chimica Acta, 2011,685:162-169.

[20]Ripollés C, Lewis A C, Borrull F, et al. Determination of eight nitrosamines in water at the ng·L-1levels by liquid chromatography coupled to atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2011,702:62-71.

[21]Kocak D, Ozel M Z, Gogus F, et al. Determination of volatile nitrosamines in grilled lamb and vegetables using comprehensive gas chromatography-Nitrogen chemiluminescence detection[J]. Food Chemistry, 2012,135:2215-2220.

[22] Yoon S, Nakada N, Tanaka H. A new method for quantifying N-nitrosamines in wastewater samples by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 97: 256-261.

[23]Llop A, Borrull F, Pocurull E, et al. Pressurised hot water extraction followed by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of N-nitrosamines in sewage sludge[J].Talanta, 2012, 88 :284-289.

[24]Kim H J, Shin H S. Determination of tobacco-specific nitrosamines in replacement liquids of electronic cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatogr. A, 2013, 1291:48-55.

[25]Ozel M Z, Gogus F, Yagci S, et al. Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detection[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010,48:3268-3273.

[26]McDonald J A, Harden N B, Nghiem L D, et al. Analysis of N-nitrosamines in water by isotope dilution gas chromatography-electron ionisation tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2012,99:146-154.

Determination of NDELA in Cosmetics by Gas Chromatography-thermal Energy Analyzer*

XINGKun-ming1,2,LIUHua3,WANGYi-kun1,4,ZHULing1,LIUYong1,WANGAn1,JIMin1,4

(1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Sciences, Chinese Academy of Sciences,Anhui Hefei 230031; 2 University of Science and Technology of China, Anhui Hefei 230026; 3 Hefei Product Quality Supervision & Inspection Institute, Anhui Hefei 238000; 4 Anhui Yikangda Photoelectric Technology Co., Ltd., Anhui Hefei 230031, China)

A comprehensive analytical method based on gas chromatography-thermal energy analyzer was developed for the determination of NDELA in cosmetics. NDELA were extracted with water from cosmetic samples under ultrasonic. After high speed freeze centrifugation, the upper aqueous phase was evaporated to dryness by nitrogen. The residue dissolved in mixed solution and was cleaned up. Then the acetone eluent was filtered by microporous membrane to store in sample vial. Qualitative and quantitative analysis was carried out under thermal energy analyzer after the chromatographic separation on a DB-624(30 m×0.25 mm，1.4 μm)capillary column. The limits of quantitation for NDELA were 20 μg/kg and the recovery was from 87% to 105%. Parts of cosmetics were positive and the highest concentration reached 48 μg/kg. The method was suitable for determination of NDELA in cosmetics.

gas chromatography-thermal energy analyzer; cosmetics; NDELA

安徽省重大科學(xué)儀器專項(1510115223)。

邢昆明(1987-)，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)碩士研究生。

計敏。

O656.3

A

1001-9677(2016)023-0084-05