羅漢果醇抗腫瘤活性及其作用機制研究

符毓夏， 王 磊， 李典鵬*

( 1. 廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2. 廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室， 廣西壯族自治區中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

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羅漢果醇抗腫瘤活性及其作用機制研究

符毓夏1,2， 王 磊2， 李典鵬2*

( 1. 廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2. 廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室， 廣西壯族自治區中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

羅漢果醇是羅漢果皂苷的苷元，有研究報道羅漢果皂苷V具有防癌抑癌作用。該研究采用噻唑藍實驗(MTT法)檢測羅漢果醇對不同腫瘤細胞增殖的抑制情況，以及不同濃度的羅漢果醇對CNE1細胞的增殖抑制率；應用細胞克隆形成實驗進一步驗證羅漢果醇對CNE1細胞增殖的抑制作用；采用Annexin V/PI 雙染法檢測羅漢果醇對CNE1細胞凋亡的影響；以實時定量PCR技術檢測羅漢果醇對CNE1細胞中Caspase-3、Survivin、 Bax和Bcl-2基因的mRNA 表達水平的影響。結果表明：羅漢果醇能顯著抑制DU145、HepG2、A549、CNE1、CNE2細胞的增殖，其中對CNE1細胞增殖的抑制作用最為顯著，并呈劑量依賴性，其半數抑制濃度IC50為(81.48 ± 4.73) μmol·L-1；通過對CNE1細胞進一步的克隆形成實驗，也驗證了這一點；Annexin V/PI 雙染法可見隨著濃度的增加，凋亡比例增加；實時定量PCR技術檢測顯示羅漢果醇處理后，促凋亡基因Caspase-3、Bax的表達增加，抗凋亡基因Survivin、Bcl-2的表達減少。因此，羅漢果醇可能是通過促進Caspase-3、Bax等促凋亡基因和抑制Survivin、Bcl-2等抗凋亡基因的表達，來誘導腫瘤細胞凋亡，進而發揮抗腫瘤活性。

羅漢果醇， 抗腫瘤， 細胞增殖， 細胞凋亡， 凋亡基因

羅漢果為葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬多年生草質藤本植物羅漢果(Momordicagrosvenorii)的干燥果實。從1977年以來，羅漢果一直被《中華人民共和國藥典》收錄，也是衛生部、中醫藥管理局批準的首批藥食兩用中藥。羅漢果的民間藥用歷史已有三百多年，臨床用于治療高血壓、肺結核、哮喘、胃炎、百日咳、急、慢性氣管炎等疾病，藥理研究表明羅漢果有止咳祛痰、瀉下、保肝、增強免疫等作用(王勤和李愛媛，1999)。 羅漢果的主要有效成分為羅漢果皂苷(Mogrosides)，其苷元為葫蘆烷型的四環三萜羅漢果醇(Mogrol) (Kasai et al，1989)。根據苷元連接糖基的數目及連接位置的不同現已分離鑒定出20多種皂苷(Matsumoto et al，1990；斯建勇等，1996；李典鵬等，2000; Dianpeng et al, 2006,2007)。

成熟羅漢果主要富含羅漢果皂苷V，其甜度在蔗糖300倍以上，而熱值幾乎為零。因此，羅漢果總皂苷已廣泛應用于保健食品及飲料添加行業。同時，羅漢果皂苷V具有防癌抑癌作用(Takao & Midori，2002；Takasakia et al，2003)。但羅漢果皂苷進入體內后多在消化道中被腸內細菌分泌的糖苷鍵水解酶水解為次生苷或者苷元，隨后進入血液循環，發揮生物學活性(楊秀偉等，2007；Murata et al，2010)。也就是說羅漢果皂苷V的藥理作用主要來源于其苷元，要研究羅漢果皂苷的抗腫瘤活性及作用機制，需從苷元下手。但目前尚未見關于羅漢果醇抗腫瘤活性的相關報道。本研究采用噻唑藍實驗(MTT法)、細胞克隆形成實驗、Annexin V/PI 雙染法檢測羅漢果醇對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，并應用實時定量PCR技術研究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人前列腺癌細胞株DU145，人肝癌細胞株HepG2，人肺癌細胞株A549，人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2，購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 試劑及耗材

噻唑藍 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5- diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，MTT粉末用PBS配制成濃度為5 mg·mL-1的母液后過濾除菌避光-20 ℃保存備用；DMEM培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自hyclone公司；胰蛋白酶(Trypsin)、細胞總RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司；75 cm2培養瓶、96 孔培養板購自購于美國Corning costar 公司；雙抗(Penicillin- Streptomycin，青鏈霉素溶液)購自美國Merck 公司；熒光定量預混試劑盒購自天根生化科技有限公司。

PBS溶液由本實驗室自行配置，配方：NaCl 8.00 g，KCl 0.24 g，NaHPO3·12H2O 3.63 g，KH2PO40.20 g，溶于900 mL蒸餾水中，調pH為7.0～7.4，加水定溶至1 000 mL，120 ℃、0.5 MPa高溫高壓蒸汽滅菌0.5 h后，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 細胞株用含10%胎牛血清(FBS)、1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養液，置于37 ℃、95%濕度、含5%CO2的培養箱中培養。每1～2 d更換1次培養液，待細胞貼壁長至80%～90%融合時0.25%胰蛋白酶消化傳代，繼續培養。

1.3.2 羅漢果醇的制備 采用酸水解法從粗羅漢果皂苷Ⅴ(含量50%)制備獲得，純度為98.98%(陳冰等，2014)，將其用DMSO溶解，配成終濃度為50 mmol·L-1，用PBS稀釋成適當濃度使用。

1.3.3 MTT實驗 取長至80%～90%融合的對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成2 × 104～3 × 104個·mL-1的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。培養24 h后，分別加入不同濃度的羅漢果醇，使終濃度為6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200 μmol·L-1，另設陰性對照組，每組設4個平行孔。繼續培養72 h后，棄去50 μL培養液，每孔加入50 μL MTT(1 mg·mL-1)，于培養箱中作用4 h后，吸出上清液并每孔加入100 μL的DMSO，充分震蕩至結晶溶解后，使用酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸收值(OD值)，實驗重復3次。按以下公式計算腫瘤細胞抑制率。抑制率(Inhibitory rate，IR%)=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值) × 100%。用SPSS 18.0軟件計算半數抑制濃度(IC50)。

1.3.4 細胞克隆形成實驗 取長至80%～90%融合的對數生長期人鼻咽癌CNE1細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成3 000 個·mL-1的細胞懸液，接種于六孔板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。培養24 h后，分別加入不同濃度的羅漢果醇，使終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200 μmol·L-1，另設陰性對照組，每組設2個平行復孔。培養10～15 d。當培養板中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。用5%結晶紫染液染色20～30 min，顯微鏡下計算克隆形成數(克隆形成率 = 克隆數/接種細胞數 × 100%)， 實驗重復3次。

1.3.5 Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡實驗 取長至80%～90%融合的對數生長期人鼻咽癌CNE1細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成3×105個·mL-1的細胞懸液，接種于直徑100 mm的培養皿中，每皿5 mL，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。培養24 h后，分別加入不同濃度的羅漢果醇，使終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200 μmol·L-1，另設陰性對照組。培養24 h后收集細胞，Annexin V-FITC/PI染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 實時定量PCR技術檢測Caspase-3、Survivin、 Bax、Bcl-2基因mRNA 表達 取長至80%～90%融合的對數生長期人鼻咽癌CNE1細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成3×105個·mL-1的細胞懸液，接種于直徑100 mm的培養皿中，每皿5 mL，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。培養24 h后，分別加入不同濃度的羅漢果醇，使終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200 μmol·L-1，另設陰性對照組。培養24 h后收集細胞，用Trizol裂解提取RNA，逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應。Caspase-3上游引物序列為5′-GACATACTCCTTCCATCAA-3′，下游引物序列為5′-ATTCATAGCACAGCATCA-3′；Survivin上游引物序列為5′-ATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCT-3′，下游引物序列為5′-TCAATCCATGGCAGCCAGCTGCTCG-3′； Bax上游引物序列為5′-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3′，下游引物序列為5′-GCCACGTGGGCGTCCCAAAGT-3′； Bcl-2上游引物序列為5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′，下游引物序列為5′-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3′；GAPDH為內參基因，上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。熒光定量 PCR反應體系為7 μL ddH2O、1 μL cDNA、10 μL Super Red PreMix Plus、1 μL Primer(-F)、1 μL Primer(-R)。反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，57～62 ℃退火20 s(其中Bcl-2 57.5 ℃，Caspase-3、Survivin 59.5 ℃，Bax 61.5℃)，72 ℃延伸45 s，共35個循環。用相對定量方法(2-△△Ct)進行數據分析，擴增效率應為90%～110%。其中△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)待測組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

2 結果與分析

2.1 羅漢果醇對不同腫瘤細胞增殖的抑制作用

羅漢果醇對DU145、HepG2、A549、CNE1、CNE2細胞的增殖均有明顯的抑制作用(表1)。從表1的IC50值可以看出，羅漢果醇對鼻咽癌CNE1細胞增殖的抑制作用強于其它幾種細胞株，因此我們選擇CNE1細胞進行后續研究。

表 1 羅漢果醇對不同腫瘤細胞的半數抑制濃度

Table 1 Half inhibitory concentration of mogrol on different tumor cells

細胞株Cellline前列腺癌細胞DU145肝癌細胞HepG2鼻咽癌細胞CNE1肺癌細胞A549鼻咽癌細胞CNE2半數抑制濃度IC50(μmol·L?1)90．28±2．6990．31±2．1381．48±4．7389．51±3．9584．04±3．74

2.2 不同濃度羅漢果醇對CNE1細胞增殖的抑制作用

圖1顯示，不同濃度的羅漢果醇對CNE1細胞具有不同的抑制作用，隨著濃度的上升，抑制率不斷增加，在濃度為200 μmol·L-1時，抑制率達到了100%。在羅漢果醇處理鼻咽癌CNE1細胞48 h后，在顯微鏡下觀察發現，在高濃度下，細胞極度皺縮，細胞核凝縮，板底已可見碎渣樣物質；在中濃度下，細胞體積縮小、貼壁率降低，且部分呈碎塊狀；在低濃度下的細胞與對照組細胞相比，細胞形態沒有明顯的區別，如圖2所示。這從形態學上表明，不同濃度的羅漢果醇對CNE1細胞的抑制程度不同。

圖 1 不同濃度羅漢果醇對CNE1細胞增殖的抑制作用Fig. 1 Inhibition of different concentrations of mogrol on the proliferation of CNE1 cells

2.3 發羅漢果醇對鼻咽癌CNE1細胞克隆形成的抑制作用

克隆形成率反映了細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。為了進一步檢測羅漢果醇對CNE1細胞增殖能力的影響，我們進行了克隆形成實驗。通過對形成的克隆進行計數并計算克隆形成率，結果發現不同濃度的羅漢果醇(50、100、200 μmol·L-1)處理CNE1細胞后，形成的克隆數各不相同(圖3)，50、100、200 μmol·L-1羅漢果醇處理組的克隆形成率分別為(72.45 ± 13.67)%、 (18.45% ± 7.51)%和(12.64% ± 8.66)%。其中，100、200 μmol·L-1羅漢果醇處理組與對照組 [(71.33 ± 15.92)%]相比，差異具有顯著性(P<0.05)。這進一步驗證羅漢果醇對CNE1細胞增殖的抑制作用。

2.4 羅漢果醇對鼻咽癌CNE1細胞凋亡的影響

細胞凋亡是指在一定的生理或病理條件下，為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。研究表明，大量的小分子化合物通過誘導細胞凋亡，進而發揮抗腫瘤活性。為了檢測羅漢果醇是否通過誘導腫瘤細胞凋亡而抑制其增殖，我們采用Annexin V/PI 雙染流式細胞術對不同濃度的羅漢果醇誘導CNE1細胞凋亡的水平進行了評估。如圖4所示，羅漢果醇作用24 h后，陰性對照組細胞凋亡率為3.2%，不同濃度羅漢果醇 (25、50、100 μmol·L-1)的細胞凋亡率依次為5.4%、14.9%、24.9%，說明羅漢果醇能誘導CNE1細胞凋亡，且誘導CNE1細胞凋亡的效果具有濃度依賴性。因此，羅漢果醇對腫瘤細胞增殖的抑制作用，在一定程度上是通過誘導細胞凋亡實現的。

2.5 羅漢果醇對CNE1細胞Caspase-3、Survivin、 Bax、Bcl-2基因mRNA 表達的影響

細胞凋亡是一個受到嚴格調控的過程，它受到促凋亡基因(如Caspase-3、Bax等)和抗凋亡基因(如Survivin、Bcl-2等)的平衡調控。為了研究羅漢果醇誘導CNE1細胞凋亡的機理，我們用實時定量PCR技術檢測了羅漢果醇處理24 h后，CNE1細胞中Caspase-3、Survivin、 Bax、Bcl-2等基因mRNA的表達水平。如圖5所示，Survivin基因mRNA的表達明顯受到抑制，在25 μmol·L-1時，表達量減少至對照的67.13%，隨著濃度的升高，抑制程度隨之增強，在100 μmol·L-1時，降至對照的37.5%；Caspase-3基因mRNA的表達明顯增強，在100 μmol·L-1羅漢果醇處理時，表達量升至對照組的4.6倍，且成一定的濃度依賴性；Bcl-2基因mRNA的表達受到輕微的抑制，在100 μmol·L-1時，表達量也只是對照組的70.3%； Bax基因mRNA的表達量在用12.5 μmol·L-1和25 μmol·L-1羅漢果醇處理時，表達量與對照組相比，表達量基本無明顯變化，到50 μmol·L-1時，表達量才有明顯上升，在100 μmol·L-1時，是對照組的3.8 倍。這些結果表明，羅漢果醇通過上調Caspase-3、Bax等促凋亡基因和下調Survivin、Bcl-2等抗凋亡基因的表達，進而誘導CNE1細胞凋亡。

3 討論與結論

在用藥物治療腫瘤的過程中，細胞凋亡起著非常重要的作用，因為大多數的抗腫瘤藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡來發揮它們的抗腫瘤效應的。本研究通過MTT實驗發現羅漢果醇對CNE1細胞的增殖有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴性，細胞克隆形成實驗進一步驗證了這一點。Annexin V/PI 雙染流式細胞術發現羅漢果醇可誘導CNE1細胞發生凋亡，且隨著濃度的上升，凋亡率隨之增加。因此羅漢果醇可能通過誘導腫瘤細胞發生凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖，發揮抗腫瘤作用。在腫瘤細胞中凋亡相關基因的調控起著重要的作用，它們的突變、缺失和過表達， 都將會使細胞增殖失去控制或凋亡受到阻礙。Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3是細胞凋亡過程中發揮重要功能的凋亡執行蛋白之一，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能，Caspase-3基因的過表達會誘導細胞發生凋亡。Survivin是至今發現的凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)中作用最強的凋亡抑制蛋白之一，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織中。閔玲等(2003)研究表明，Survivin在CNE1細胞中表達。其表達的程度與腫瘤的發展及預后密切相關(Rosenblatt et al，2008；Weiss et al, 2009；Nouraee et al，2009)。Survivin直接作用于Caspase，主要通過抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性來阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程。本研究結果表明，羅漢果醇作用于CNE1細胞后Survivin基因mRNA 表達降低，Caspase-3基因mRNA的表達增強。表明羅漢果醇可能是通過降低survivin的表達，使腫瘤細胞的凋亡抑制作用減弱，從而上調Caspase-3的表達，促使腫瘤細胞發生凋亡。Bcl-2是抑制凋亡作用的基因，能夠通過阻礙損傷的DNA轉錄出有激活細胞凋亡相關基因信號或阻止相關基因產物產生的作用以抑制細胞的凋亡。Bax是促細胞凋亡的基因，其中21%的氨基酸與Bcl-2同源，能夠與抗凋亡基因Bcl-2形成異源二聚體抑制Bcl-2，從而促進細胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax的比率決定了細胞的凋亡與否，當Bax居多時，Bcl-2被抑制，凋亡也隨之被誘導；反之，則Bax會受到抑制，即細胞凋亡被抑制，細胞得以繼續生存(Yin et al，1994)。本文中Bax基因mRNA表達增多，Bcl-2基因mRNA表達被抑制，表明羅漢果醇可能通過促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達來誘導細胞凋亡。羅漢果醇可以通過誘導細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖，發揮抗腫瘤作用，但其確切抗腫瘤活性有待于在動物水平上進一步研究。

圖 2 羅漢果醇對CNE1細胞形態的影響 A. 對照； B. 低濃度(25 μmol·L-1)； C. 中濃度(100 μmol·L-1)； D. 高濃度(200 μmol·L-1)。Fig. 2 Effects of mogrol on the morphology of CNE1 cells A. Control; B. Low concentration (25 μmol·L-1); C. Medium concentration(100 μmol·L-1); D. High concentration (200 μmol·L-1).

圖 3 羅漢果醇CNE1細胞克隆形成的影響 A. 對照； B. 50 μmol·L-1； C. 100 μmol·L-1； D. 200 μmol·L-1。Fig. 3 Effects of mogrol on the colony formation of CNE1 cells A. Control; B. 50 μmol·L-1; C. 100 μmol·L-1; D. 200 μmol·L-1.

圖 4 羅漢果醇對鼻咽癌CNE1細胞凋亡的影響 A. 對照； B. 25 μmol·L-1； C. 50 μmol·L-1； D. 100 μmol·L-1。Fig. 4 Effects of mogrol on the apoptosis of CNE1 cells A. Control; B. 50 μmol·L-1; C. 100 μmol·L-1; D. 200 μmol·L-1.

圖 5 羅漢果醇對CNE1細胞mRNA 表達的影響 A. Survivin； B. Caspase-3； C. Bcl-2； D. Bax； 與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 Effects of mogrol on the expression of mRNA in CNE1 cells A. Survivin； B. Caspase-3； C. Bcl-2； D. Bax； Compared with the control group, *means significant differences (P<0.05).

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Activity and mechanism of anticancer properties of mogrol

FU Yu-Xia1,2, WANG Lei2, LI Dian-Peng2*

( 1.GuangxiNormalUniversity, Guilin 541004, Guangxi, China; 2.GuangxiKeyLaboratoryofFunionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,GuangxiZhuangAutonomousRegionandChineseAcademyofSciences, Guilin 541006, Guangxi, China )

Mogrol is the aglycone of mogrosides, and it is reported that Mogroside V has good cancer prevention and anti-cancer efficacy. This study was to explore the inhibitroy effects of mogrol against proliferation of human nasopharyngeal cancer CNE1 cells, and the molecular mechanism of apoptosis induced by mogrol. The inhibitory activities of different tumor cells were assessed by MTT assay. The concentration-dependent inhibition by mogrol on the most sensitive CNE1 cells were further studied. Cell clonogenicity was detected by colonyforming assay to further verification the inhibition of mogrol on the proliferation of CNE1 cells. And the apoptosis was examined by Annexin V/PI double staining. To further analyze the apoptosis mechanism of cell apoptosis, we detected the Caspase-3, Survivin, Bax and Bcl-2 mRNA expression levels in CNE1 cells after treating with mogrol by real time-PCR. The results showed that mogrol could significantly inhibit the proliferation of DU145, HepG2, A549, CNE1, CNE2 cells, the inhibitory effect of CNE1 cells was the most significant and in a dose-dependent manner, the IC50was (81.48 ± 4.73) μmol·L-1. The colonyforming assay also verified that mogrol could inhibit the proliferation of CNE1 cells. Apoptosis of CNE1 cells was examined by Annexin V/PI double staining, the apoptosis rate was increased with concentration. Real time-PCR showed that mogrol could promote the expression of Caspase-3, Bax genes and inhibit the expression of survivin, Bcl-2 genes. Therefore, mogrol can probably induce the apoptosis of tumor cells, and result in anti-tumor activity, by promoting the expression of Caspase-3, Bax and other pro-apoptotic genes and inhibiting the expression of survivin Bcl-2 and other anti-apoptotic genes.

mogrol， antineoplastic， cell proliferation， apoptosis， apoptotic genes

10.11931/guihaia.gxzw201502025

2015-11-23

2016-02-25

國家自然科學基金(81160392,81160518,21562009) [Supported by the National Natural Science Foundation of China(81160392,81160518, 21562009)]。

符毓夏(1988-)，女，廣西欽州人，碩士，細胞生物學專業，(E-mail)fuyusha88@163.com。

*通訊作者： 李典鵬，博士，研究員，碩士研究生導師，從事天然藥物化學成分研究，(E-mail)ldp@gxib.cn。

Q946， R285

A

1000-3142(2016)11-1369-07

符毓夏， 王磊， 李典鵬. 羅漢果醇抗腫瘤活性及其作用機制研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(11):1369-1375

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