補腎活血中藥復方對AGEs及缺氧狀態下體外純化培養視網膜Müller細胞活力的影響

秦偉，謝學軍，李志英，楊宇琦，宋明霞，曹新偉，馬殿偉，榮素然，陳一兵，王雪菁

補腎活血中藥復方對AGEs及缺氧狀態下體外純化培養視網膜Müller細胞活力的影響

秦偉1，謝學軍2，李志英3，楊宇琦1，宋明霞2，曹新偉2，馬殿偉2，榮素然2，陳一兵1，王雪菁1

目的觀察補腎活血中藥對體外晚期糖基化終末產物（AGEs）及缺氧條件下視網膜Müller細胞活力的影響。方法采用SD大鼠制備補腎活血中藥含藥血清和空白血清，以終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉制作細胞缺氧環境，以終濃度50 mg/L的AGEs作為低AGEs條件，終濃度100 mg/L的AGEs作為高AGEs條件，將體外純化培養的P2代視網膜Müller細胞分為6組，分別置于加入空白血清、中藥含藥血清、空白血清+低AGEs+連二亞硫酸鈉、空白血清+高AGEs+連二亞硫酸鈉、中藥含藥血清+低AGEs+連二亞硫酸鈉、中藥含藥血清+高AGEs+連二亞硫酸鈉的DMEM培養基中，培養48 h后檢測各組乳酸脫氫酶（LDH）漏出量，比較差異。結果（1）低AGEs+缺氧組較正常對照組LDH值有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；高AGEs+缺氧組較正常對照組LDH值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。（2）正常中藥干預組LDH數值與正常對照組接近，差異無統計學意義（P＞0.05）。（3）兩組不同劑量AGEs+缺氧中藥干預組LDH漏出量均較對應的低、高AGEs+缺氧組明顯降低，其差異有統計學意義（P＜0.05）。結論AGEs及缺氧條件可導致體外純化培養的大鼠視網膜Müller細胞細胞膜穩定性下降，通透性增加，細胞活力降低，補腎活血中藥含藥血清可提高AGEs及缺氧條件下視網膜Müller細胞活力，這可能是補腎活血中藥防治糖尿病性視網膜病變（DR）的機制之一。

補腎活血；Müller細胞；糖基化終末產物；缺氧；乳酸脫氫酶

糖尿病性視網膜病變（diabeic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥，成人主要致盲疾病之一。DR發病機制有晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）形成堆積、細胞生長因子異常、多元醇肌醇代謝異常等，其中AGEs的形成和堆積，可導致氧化應激作用增強、血管舒縮調節功能異常、細胞外基質結構和功能異常、白細胞黏滯性增加并影響視網膜血管內皮細胞、周細胞、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的生理功能，使視網膜屏障受到破壞〔1〕，可作為DR微血管病變的獨立危險因素；同時由于視網膜感光細胞的高能耗及自主調節力差等原因視網膜缺氧也是DR的主要發病機制之一〔2〕。目前多項實驗表明視網膜Müller細胞在DR疾病過程中起重要作用，包括影響視網膜的代謝狀況，破壞視網膜精細結構，分泌多種生長因子等，并可能參與免疫細胞增殖及視網膜神經細胞損傷過程〔3〕。我們的前期研究表明補腎活血中藥復方〔4-8〕是治療DR的一種有效方法，本實驗旨在研究AGEs及缺氧條件下補腎活血中藥復方對視網膜Müller細胞活力的影響，為臨床更好地應用補腎活血中藥防治DR提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑

視網膜Müller細胞純化培養：清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠9只，新生7 d，雌雄不限[成都中醫藥大學實驗動物中心提供（川實動管質第99-11號）]。

補腎活血中藥復方含藥血清：清潔級SD大鼠50只，體質量150～180 g，8～12周齡，雌雄各半[成都中醫藥大學實驗動物中心提供（川實動管質第99-11號）]。

實驗試劑：連二亞硫酸鈉（天津濱海科迪有限公司）；谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）鑒定Ⅰ抗兔多克隆抗體（SANTA CRUZ，美國），Ⅱ抗生物素化羊克兔抗體（SANTA CRUZ，美國）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑（Bio-Rad，美國）。

1.2中藥含藥血清制備

補腎活血中藥復方（由人參須、丹參、地黃、葛根等組方，成都中醫藥大學提供）。SD大鼠50只，體質量120～150 g，隨機分為補腎活血中藥復方血清組（中藥含藥血清組）、空白對照組（空白血清組）兩組，每組25只，制備對應的動物血清，具體方法同前期研究〔9〕。

1.3視網膜Müller細胞原代及傳代培養及鑒定

SD大鼠9只，新生7 d，酶消化法體外純化傳代培養視網膜Müller細胞，GS免疫組化染色鑒定，實驗細胞取用P2代細胞；具體方法同前期研究〔9〕。

1.4實驗分組

實驗1組：正常對照組，DMEM培養基，含20%空白血清。

實驗2組：正常中藥干預組，DMEM培養基，含20%中藥含藥血清。

實驗3組：低劑量AGEs+缺氧組，含20%空白血清的DMEM培養基+終濃度為50 mg/L的AGEs+終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

實驗4組：低劑量AGEs+缺氧中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養基+終濃度為50 mg/L的AGEs+終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

實驗5組：高劑量AGEs+缺氧組，含20%空白血清的DMEM培養基+終濃度為100 mg/L的AGEs+終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

實驗6組：高劑量AGEs+缺氧中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養基+終濃度為100 mg/L的AGEs+終濃度1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

1.5視網膜Müller細胞LDH漏出量的測定

將密度為2×106/ml的P2代Müller細胞接種于48孔培養板，每孔400 μl；培養24 h，棄用含有血清的培養液，加入無血清的培養液，培養24 h，棄用無血清培養液，加入上述分組不同條件培養液，培養干預48 h；每孔收集培養基上清液50 μl，并快速加入LDH檢測試劑（參照LDH試劑盒說明書操作），使用490型酶標儀檢測光密度D（440nm）的變化，計算LDH值，單位：U/L。

1.6統計分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，定量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1視網膜Müller細胞鑒定結果

純化培養原代視網膜Müller細胞，GS染色陽性率大于80%，表現為大量棕色陽性反應位于細胞核及細胞漿內，細胞周圍可見稍淺的免疫陽性反應，勾勒出的帶有終足以及蹼形爪的扁平細胞輪廓，P1代與P2代細胞GS染色陽性率均在85%以上（圖1，圖2）。

圖1 SD大鼠原代視網膜Müller細胞培養5 d后倒置顯微鏡像（×100）；圖2SD大鼠P2代視網膜Müller細胞培養5d后谷氨酰胺合成酶（GS）染色像（×200）

2.2AGEs及缺氧條件對體外純化培養視網膜Müller細胞LDH漏出量的影響

正常對照組與正常中藥干預組的數值接近（P＞0.05），兩組AGEs+缺氧樣本的LDH漏出量高于正常對照組和正常中藥干預組，并以高AGEs+缺氧組的數值最大（P＜0.05）。加入中藥干預的AGEs+缺氧樣本LDH漏出量較對應AGEs劑量未加中藥干預樣本的數值明顯降低（P＜0.05），與正常對照組的數值相當或低于正常對照組（P＜0.05）。

表1 各組視網膜Müller細胞LDH漏出量比較（x±s，U/L）

3 討論

DR屬祖國醫學“消渴目病”范疇，基本病機為氣陰兩虛、肝腎不足，瘀血阻絡、痰濁內生及痰瘀互結，以肝腎虧虛為本，以瘀為標〔10〕。因此當以滋補精血、補益肝腎為治療之本，并以活血化瘀通絡之法貫穿治療始終。據此我們自擬補腎活血中藥復方用于治療DR。前期研究表明〔4-8〕它是治療DR的一種有效方法。

細胞膜具有通透性，其通過選擇性的控制物質進出細胞膜而控制細胞內外的物質交換，從而使細胞處于一個相對穩定的環境中。細胞的代謝障礙，首先就表現為細胞膜的通透性發生障礙。有學者認為糖尿病患者發生各類并發癥的一個重要基礎病變就是細胞膜系統的異常，它是導致細胞內外環境改變的基本條件〔2〕。乳酸脫氫酶（LDH）是一種活細胞內的特異性標志酶，正常情況下細胞外漏出量很少，當病理條件下細胞膜的通透性發生障礙時，胞外的LDH漏出量則明顯增多，且其累計漏出量與受損細胞數量呈正相關〔11〕。可見，病理條件下細胞膜越不穩定，細胞外LDH漏出量越多。因此，LDH細胞外釋放量就可作為一個反映視網膜Müller細胞在DR早期功能受損情況的敏感指標。本實驗結果顯示，低劑量AGEs+缺氧組、高劑量AGEs+缺氧組較正常對照組的LDH值均升高，高劑量AGEs+缺氧組差異有統計學意義（P＜0.05）。提示在AGEs+缺氧條件下，體外純化培養的大鼠視網膜Müller細胞受損，細胞膜穩定性下降，通透性增加，活性減弱。

同時本實驗結果顯示，補腎活血中藥復方含藥血清對正常條件下體外純化培養視網膜Müller細胞的LDH漏出量無明顯影響（P＞0.05），提示補腎活血中藥復方含藥血清對正常條件下視網膜Müller細胞的細胞活性無明顯影響；加入中藥干預的AGEs+缺氧樣本LDH漏出量較對應AGEs劑量未加中藥干預樣本的數值明顯降低（P＜0.05），與正常對照組的數值相當或低于正常對照組（P＜0.05），提示補腎活血中藥復方含藥血清能明顯提高AGEs+缺氧條件下視網膜Müller細胞細胞膜穩定性、降低細胞膜通透性，從而減輕細胞損害，提高細胞活力。因此，筆者推測，補腎活血中藥復方能提高糖尿病性視網膜病變（DR）患者視網膜Müller細胞細胞膜的穩定性，增強視網膜Müller細胞活力，這可能是補腎活血中藥復方防治DR的機制之一。

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Effect of Bushen Huoxue decoction on retinal Müller cells cultured in AGEs and hypoxic condition

QIN Wei，XIE Xuejun，LI Zhiying，et al.Hospital of TCM of Zhongshan，Zhongshan 528400，China

OBJECTIVETo investigate the protective effect of Bushen Huoxue（BSHX）decoction on retinal Müller cells（RMCs）of rats purified in vitro under AGEs and hypoxic conditions.METHODSThe serum containing Bushen Huoxue Decoction and blank serum were prepared from SD rats.The cell hypoxia environment was made by sodium hyposulfite（SH）with the final concentration of 1 mmol/L.The concentration of 50 mg/L was set as low AGEs condition，and 100 mg/L as high AGEs condition.The purified P2 retinal Müller cells（RMCs）of new born and 7 day-rats were cultured by modified enzyme-digestion method.Purified RMCs were divided into 6 groups，two of them were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）which were added in blank serum，medicated serum while four of them were cultured under hypoxic and AGEs condition in DMEM which contained blank serum with low AGEs and SH，blank serum with high AGEs and SH，medicated serum with low AGEs and SH，medicated serum with high AGEs and SH.After 48 hours，the lactic acid dehydrogenase（LDH）leakage were detected and compared.RESULTSComparison in alternative pairs showed that，the leakage of low AGEs and hypoxia group was higher than blank group，but the difference was of no statistical difference（P>0.05）.However，the index of high AGEs and SH under medication group was much higher than blank group（P<0.05）.The leakage of blank group andmedicated group were similar（P>0.05）.Indexes of each AGEs plus hypoxia group were all higher than their counterparts in same condition under medication groups and the difference were all significant（P<0.05）.The leakage of LDHobviouslydecreasedbyTCMinterventionunderdifferentaddedconditionsofthisexperiment.CONCLUSIONSThe hypoxic plus AGEs condition caused decrease of stability，increase of permeability and decline of cell viability of RMCs while BSHX boosted the cell viability of RMCs under hypoxia and AGEs which might be one of the mechanism explaining preventative and curative effects of Bushen Huoxue decoction on diabetic retinopathy.

Bushen Huoxue；retinal Müller cells；advanced glycation end products；hypoxia；lactate dehydrogenase

R285

A

1002-4379（2016）04-0215-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.002

國家自然科學基金資助項目（81072845）；廣東省中醫藥管理局資助項目（20164030）；廣東省中山市科技局資助項目（2016B1050）

1.廣州中醫藥大學附屬中山醫院，廣東中山528400

2.成都中醫藥大學眼科教研室，成都610075

3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院眼科，廣州510000

謝學軍，E-mail：xxj_chd@yahoo.com.cn