生長激素基因在西藏小型豬不同生長階段和不同組織器官中的表達

田雨光，王玉玨，岳 敏

(南方醫科大學實驗動物中心暨比較醫學研究所，廣州 510515)

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研究報告

生長激素基因在西藏小型豬不同生長階段和不同組織器官中的表達

田雨光，王玉玨，岳 敏

(南方醫科大學實驗動物中心暨比較醫學研究所，廣州 510515)

目的對西藏小型豬生長激素基因在不同臟器和不同年齡階段的表達水平進行測定。方法采用Real-time PCR的方法,以GAPDH為內參,定量分析0歲(1日齡)、0.1歲(36日齡)、0.25歲(90日齡)、0.5歲(180日齡)、1歲(360日齡)、2歲(720日齡)、3歲(1080日齡)的西藏小型豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚組織中生長激素基因mRNA表達水平,并且進行比較分析。結果生長激素基因在各個年齡階段的西藏小型豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚中均有表達。在不同臟器的表達中,生長激素基因在0歲、0.5歲時皮膚中的表達量最高,肌肉組織中的表達量最低。在0.25歲、1歲時肺組織中表達量最高,在0.1歲、3歲時肝臟表達量最高；在不同年齡階段的表達中,生長激素基因在0.1歲時表達達到峰值。結論西藏小型豬的生長激素基因的表達呈現出明顯的時空特異性。

西藏小型豬；生長激素基因；實時熒光定量PCR

生長激素(growthhormone,GH)是神經內分泌生長軸中調控動物生長發育的核心,是一種具有廣泛生理功能的生長調節素,能影響幾乎所有組織類型和細胞,甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統[1]。豬的GH基因全長2231 bp,是由190個氨基酸殘基組成的單鏈多肽[2],與牛的90%的氨基酸同源性,但兩者與人的GH同源只有65%[3]。豬的GH基因由5個外顯子和4個內含子構成。外顯子大小分別為10、161、117、162和198 bp,內含子大小分別為242、210、197和278 bp,編碼前導肽的為78 bp,編碼成熟區的為570 bp,豬GH基因已被定于12號染色體[4-6]。不同種動物或同種不同個體之間的生長速度的顯著差異與GH基因的結構和表達水平有著密切相關性[7]。豬生長激素通過其受體(GHR)實現信號的傳遞,豬GH只受一個因子即生長激素因子Ⅰ(GHF-Ⅰ)的調控,GHF-Ⅰ不僅維持GH基因的組織特異性表達,而且使表達具有發育階段性[8]。對豬的GH基因在不同組織及年齡階段的表達情況少有報道,本文旨在探討西藏小型豬GH基因表達的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及采樣

選用0歲(1日齡)、0.1歲(36日齡)、0.25歲(90日齡)、0.5歲(180日齡)、1歲(360日齡)、2歲(720日齡)、3歲(1080日齡)的西藏小型豬,每個年齡段各3頭，共21頭。西藏小型豬來自南方醫科大學實驗動物中心【SCXK(粵)2011-0015】,相同的飼養環境。在南方醫科大學實驗動物中心大動物實驗室【SYXK(粵)2011-0074】處死后,立即取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚組織,立即放入去除RNA酶的1.5 mL EP管中,迅速投入液氮中,帶回實驗室備用。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑

DEPC處理水：1000 mL ddH2O中加入0.1 mL DEPC,于37℃過夜溫育后高壓滅菌。TRIZOL Reagent,購自Invitrogen公司。無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇，購自廣東省化學試劑工程技術研究開發中心。引物由Invitrogen廣州分公司合成。PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR Premix DimerEraser(Perfect Real Time)購自Takara公司。

1.2.2 儀器

熒光定量PCR儀(美國伯樂),紫外分光光度計(美國熱電),水平電泳儀(美國伯樂),凝膠成像系統(杭州朗基科學儀器有限公司),高溫烤箱(上海一恒科學儀器有限公司),恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 各種組織總RNA的提取及質量測定

各種組織中總RNA用酚-氯仿一步法提取,紫外分光光度計測定濃度。

1.3.2 反轉錄

使用Takara SYBR Premix DimerEraser(Perfect Real Time)試劑盒進行RT-PCR反應。反應體系為20 μL：包括5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL, Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1 μL, Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL, Total RNA 1 μg,加RNase free DH2O到20 μL。反應液配制在冰上進行。反轉錄反應條件為：37℃ 15 min(反轉錄反應),85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)。

1.3.3 引物設計及PCR擴增條件

根據GenBank上豬的GH基因(X53325)、GAPDH基因(AF017079)設計引物為GHF: 5′-ATC ACATCCTCTTCGCATCTCTT-3′;GHR: 5′-TGAAATAA AAGCCCCTGTCTCC-3′;GAPDHF：5′-TTGGCTACAGC AACAGGG-3′；GAPDHR: 5′-CTGGGATGGAAACTGG AAGT-3′。以樣品的cDNA第一鏈為模版,擴增GH基因,以GAPDH作為內參。于冰上避光加樣操作,混勻,瞬時離心進行PCR擴增,擴增體系為20 μL，包括：SsoFast EvaGreen supermix(1×)10 μL；Forward primer(300 nmol/L)1 μL；Reverse primer(300 nmol/L)1 μL；RNase/DNase-free water 7 μL； cDNA template 1 μL。熒光定量PCR反應參數為：95℃ 30 s、40個循環(95℃ 1 min、55℃ 1 min，72℃ 30 s)、72℃ 10 min。1.4 熒光定量數據處理及統計學分析

每個時間點3個樣本,每個樣本設3個復孔。根據信噪情況的設定和調整基線和閾值,通過獲得的熒光曲線和Ct值判定結果。根據GAPDH作為參照物,從而得出西藏小型豬GH在測定組織中的mRNA相對表達量。利用SPSS13.0統計學軟件對數據進行重復測量數據的方差分析。

2 結果

2.1 組織樣品中總RNA的提取效果鑒定

圖1 RNA電泳圖Fig.1 Detection of total RNA

提取好西藏小型豬各個組織總RNA后,采用瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定,鑒定結果見圖1,18S和28S條帶清晰,結果說明RNA具有較好的完整性。總RNA能夠達到要求,進而反轉錄為cDNA。

2.2 西藏小型豬GH基因的實時熒光定量PCR檢測分析

GH基因的擴增曲線及融解曲線如圖2。擴增曲線標準,基線期、對數期和平臺期三階段分期明顯,融解曲線均在一條直線上,圖形為平滑的單峰曲線,且Tm溫度附近無雜峰,表明引物特異性較好,沒有因為引物二聚體及非特異性擴增而產生的雜帶熒光干擾。說明實驗結果可信度較高,能真實反應檢測到的基因的表達水平。

2.3 GH基因在不同臟器及不同年齡階段的組織表達分析

以GAPDH為內參,根據組織內基因擴增的域值循環數(Ct值),來計算GH基因的mRNA相對表達水平。從表4可以看出：在不同臟器的表達中,GH基因在0歲、0.25歲、0.5歲、1歲、2歲表達量最低都是肌肉,在0歲、0.5歲時在皮膚中的表達量最高,在0.25歲、1歲時在肺組織中表達量最高,在0.1歲、2歲、3歲時表達量最高的是肝臟。從圖3、表5中可以看出,在不同年齡階段的表達中,GH基因在0.1歲時達到峰值。所以西藏小型豬的生長激素基因的表達呈現出明顯的時空特異性。

經統計學分析發現西藏小型豬GH基因在不同臟器中的表達有顯著性差異(P<0.05),在不同年齡階段的表達也均有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 西藏小型豬GH基因片段實時定量擴增曲線和融解曲線Fig.2 Amplification plots and dissociation curves of Tibet mini-pig GH gene

表4 西藏小型豬生長激素基因在不同臟器中的mRNA相對表達Tab.4 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression in different organs

表5 西藏小型豬生長激素在不同年齡階段中的mRNA相對表達Tab.5 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression in different age stages

圖3 西藏小型豬生長激素基因 mRNA在不同年齡階段的相對表達趨勢圖Fig.3 GH mRNA of Tibet mini-pig relative expression tendency in different age stages

3 討論

對于動物來說,不同品種、不同生長發育階段及不同臟器,基因表達差異都較大。本研究通過實時熒光定量PCR測定了西藏小型豬的GH基因在不同年齡階段不同組織中的表達分布情況。

2013年單艷菊等[9]采用實時熒光定量PCR方法研究生長速度不同的高郵鴨和金定鴨13、17、21、25、27胚齡和出雛后7日齡時垂體GH基因mRNA的表達水平。結果表明兩個鴨種垂體GHmRNA表達水平均隨著胚齡(或日齡)的增加而增加,而本文就西藏小型豬GH基因在不同年齡階段中同一臟器中的表達進行研究同樣發現表達具有一定的規律,GH基因在所有臟器中均在0.1歲時達到了峰值,后不斷降低。2015年閆云峰[10]等利用熒光定量PCR SYBR Green Ⅰ熒光染料法,對綿羊腸系膜淋巴結、心臟、肝臟、垂體、大腦、腎臟、骨骼肌、皮膚、肺臟、睪丸和脾臟11個組織中的GH基因的表達水平進行相對定量分析。結果表明,GH基因在睪丸、腸系膜淋巴結和脾臟中的表達量顯著高于心臟、肝臟、大腦、腎臟和骨骼肌,同樣本文研究GH基因在同一年齡階段不同臟器的表達中,GH基因在0歲、0.25歲、0.5歲、1歲、2歲表達量最低都是肌肉,在0歲、0.5歲時在皮膚中的表達量最高,在0.25歲、1歲時在肺組織中表達量最高,在0.1歲、2歲、3歲時表達量最高的是肝臟。說明在同一年齡階段,不同臟器表達量均不同。比較有特點是：在0歲、0.5歲時表達量最高的是皮膚,最低的是肌肉；0.25歲時表達量最高的是肺組織,最低的是肌肉。所以西藏小型豬的生長激素基因的表達呈現出明顯的時空特異性。

[1] 鄭茂恩,潘登科,馬月輝,等.小型豬生長激素基因研究進展[J].實驗動物科學,2007,24(6)：107-110.

[2] Vize P D,Wells J R E. Isolation and characterization of the porcine growth hormone gene[J]. Gene,1987,55(2-3):339-344.

[3] 劉德武,楊關福,張細權.豬神經內分泌生長軸各因子及相關基因的研究進展[J].農業生物技術學報,2014,12(1)：109-115.

[4] Yerle M,Lahbib-Mansais Y,Thomsen P D,etal. Localization of the porcine growth hormone gene to chromosome 12 pl.2—>p1.5[J].Anim Genet,1993,24(2):129-131.

[5] Larsen N J,Nielsen V H. ApaⅠ and CfoⅠ polymorphisms in the porcine growth hormone gene[J].Anim Genet,1993,24(1):71.

[6] 王玉玨,岳敏，顧陽,等.西藏小型豬GH基因部分序列的SNP分析[J].中國比較醫學雜志,2015,25(1):50-54.

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[9] 單艷菊,束婧婷,徐文娟,等. 不同鴨種胚胎期和岀雛早期生長軸GH、GHR和IGF-Ⅰ基因mRNA差異表達分析[J].農業生物技術學報,2013，21(4)：421-427.

[10] 閆云峰,楊華,楊永林,等.薩福克羊GH和IGF-1基因組織表達水平的分析[J].家畜生態學報，2014，35(4)：18-28.

Study on the expression of Growth Hormone gene in different tissues and different growth stages of Tibet-minipigs

TIAN Yu-guang, WANG Yu-jue, YUE Min

(Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou 510515,China)

Objective To study the expression of Growth Hormone (GH) gene in different tissues and different growth stages of Tibet-minipigs. Methods The expression level ofGHgene in heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, skin tissue of Tibet mini-pig was analyzed by Real-time PCR in 0 years old (1 days), 0.1 years old (36 days), 0.25 years old (90 days), 0.5 years old (180 days), 1 years old (360 days), 2 years old (720 days), and 3 years old (1080 days).ResultsThe expressions ofGHmRNA could be detected in various tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, skin) in different growth stages (0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 years old) in Tibet mini-pigs. TheGHgene was most highly expressed in skin in 0, 0.5 years old and most lowly expressed in muscle comparing with other tissues. Moreover, theGHgene was also most highly expressed in lung and liver in 0.25, 1 years old and 0.1, 3 years old, respectively. The expression level ofGHgene reached the peak in 0.1 years old among different growth stages. Conclusion The expression ofGHgene in Tibet mini-pig showed an obvious temporal and spatial specificity.

Tibet-minipigs；GHgene；Real-time PCR

國家自然科學基金(801402625)；中國博士后自然科學基金(2014M550439)；廣東省科技計劃項目(2016A030303008)；南方醫科大學2015科研助手項目(C1032246)。

田雨光(1987-)，男，理學博士，研究方向：比較醫學和人類疾病動物模型。E-mail： yuguang.tian@qq.com。

岳敏(1982-)，女，醫學博士，實驗師，研究方向：比較醫學和人類疾病動物模型。E-mail： 343779791@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.001

2016-07-12