急性肺水腫大鼠肺組織中IL-6，SOD和MDA的變化

王 娟，賈合磊，吉紅亮，任冬冬，盧長青

(1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院急診科，鄭州 450002；2.鄭州市鄭榮醫院普內科，鄭州 450002)

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研究報告

急性肺水腫大鼠肺組織中IL-6，SOD和MDA的變化

王 娟1，賈合磊1，吉紅亮2，任冬冬1，盧長青1

(1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院急診科，鄭州 450002；2.鄭州市鄭榮醫院普內科，鄭州 450002)

目的探討急性缺氧致大鼠急性肺水腫模型肺組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和白細胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)的變化及其意義。方法成年Wistar大鼠50只，隨機分為A組(正常組)、B組(急性肺水腫模型，缺氧24 h)、C組(急性肺水腫模型，缺氧48 h)，D組(急性肺水腫模型，缺氧72 h)和E組(急性肺水腫激素治療組，缺氧72 h)。對B，C，D，E組大鼠腹腔內注射6%氯化氨建立急性肺水腫模型，E組在注入6%氯化氨30 min后經尾靜脈給藥，給予地塞米松6.0 mg/kg。造模成功后的24 h，48 h，72 h，分別處死4組大鼠，分離大鼠血漿，摘取大鼠肺臟，制備10%肺組織勻漿，用ELISA檢測肺組織中MDA、SOD，IL-6和血漿中IL-6的含量和活性。結果B，C，D三組可見大鼠肺組織水腫明顯，濕重明顯增加，與A組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。A組大鼠肺組織無明顯充血水腫，肺組織形態大致正常。B，C，D大鼠模型肺組織充血水腫，肺組織間質間隙、肺泡和細支氣管內充滿含有蛋白質的液體，肺泡內有透明膜形成。且D組大鼠肺組織充血水腫最為明顯。而E組大鼠全肺組織水腫普遍較輕，HE染色顯示E組大鼠肺組織肺泡融合，間隔較小，水腫液大多已吸收，肺泡內散在少量嗜伊紅液體。B組與A組比較，肺組織中MDA，IL-6升高、SOD降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，隨著肺水腫時間的延長，C，D組大鼠肺組織中MDA升高，SOD降低，血漿中的IL-6升高，和A組相比變化明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。和D組相比，E組大鼠肺組織中MDA降低，SOD升高，血漿中的IL-6降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論急性肺水腫的發生和氧化應激有關，機體抗氧化能力降低、自由基增加是肺水腫發生的重要機制，肺組織中IL-6，SOD和MDA含量對病情變化有指導意義。

急性肺水腫；大鼠模型；丙二醛；超氧化物歧化酶；白細胞介素-6

急性肺水腫是急診科、心內科及重癥醫學科的常見的急癥之一，其臨床表現為：突然出現的嚴重的呼吸困難，端坐呼吸，伴咳嗽，常咳出粉紅色泡沫樣痰，病人煩躁不安，口唇紫紺，大汗淋漓，心率增快，兩肺布滿濕羅音及哮鳴音，嚴重者還可引起暈厥及心臟驟停[1]。由于急性肺水腫病程兇險，致死率高，因而急性肺水腫的發病機制和病程中的病理生理變化已成為近年來研究的熱門領域之一[2]。目前關于急性肺水腫的發病機制尚未完全清楚，但有研究顯示，缺氧引起肺血管過度收縮、肺毛細血管通透性增加和肺泡對液體的清除能力降低是急性肺水腫發生的重要機制之一[2]。利用模擬肺組織受損的動物模型，再現人體病理狀態和病理生理過程，對于掌握急性肺水腫發生發展、疾病特征和尋求新的治療途徑顯得尤為重要。

急性肺水腫的動物模型的建立，目前國內外已有了一定的研究[3]。有研究顯示，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)和白介素-6(IL-6)的變化可能在缺氧引起的急性肺水腫中發揮了重要作用[4]，為明確三者在其中的作用，我們建立了急性肺水腫的大鼠模型，重點研究了急性肺水腫大鼠肺組織中IL-6，SOD和MDA的變化，以明確缺氧在引發急性肺水腫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

6%氯化氨購自上海博湖生物科技有限公司，10%烏拉坦，BCA法蛋白測定試劑盒購自武漢能仁醫藥化工有限公司，SOD、MDA測定試劑盒，大鼠IL-6、ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，多功能酶標儀由美國Sigma公司生產。

成年Wistar大鼠50只，雌雄不限，體重為(200±20) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2012-0006】。隨機將50只大鼠分為5組，即A組(正常組)、B組(急性肺水腫模型缺氧24 h)、C組(急性肺水腫模型缺氧48 h)，D組(急性肺水腫模型缺氧72 h)，E組(急性肺水腫模型激素治療組)，每組10只。

1.3 動物模型的建立和實驗程序

無菌操作，在河南中醫藥大學實驗動物中心設施進行【SYXK(豫)2012-0017】。對B，C，D和E組的50只大鼠腹腔內分別注入6%氯化氨(雌鼠：6～8 mL/kg，雄鼠：9～12 mL/kg，購自上海博湖生物科技有限公司)，制作急性肺水腫大鼠模型[3]。E組在注入6%氯化氨30 min后經尾靜脈給藥，給予地塞米松6.0 mg/kg。所有大鼠均自由攝食及飲水，取材前24 h禁食水。正常組同時飼養。由專人統一時間進行取材。B，C，D和E組大鼠分別在氯化氨注入后的24 h，48 h，72 h，用10%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，肝素抗凝管腹主動脈采血，4℃離心，3000 r/min，離心15 min，分離血漿，分裝后-70 ℃冰箱保存待測; 分離并摘取大鼠肺臟，留取左側肺葉，用于肺含水量的測定，其余肺組織分裝在3個凍存管中立刻放入液氮冷凍保存。取右側肺葉，按照說明書制備10% 肺組織勻漿，分別用于檢測肺組織中MDA、SOD，IL-6的含量和活性。

1.4 大鼠肺組織含水率測定

取大鼠左肺用吸水紙吸干表面血跡，迅速稱重后放入烤箱內60 ℃烘烤72 h，至質量不再減輕，并計算肺組織干質量。肺組織含水率用[(濕質量-干質量)/ 濕質量×100%] 表示。

1.5 大鼠肺組織病理學檢查

將5組大鼠肺組織標本4 μm厚度連續石蠟切片，并行脫蠟，染色，脫水，透明，對切片進行PBS沖洗，最后加入DAB顯色液，用蘇木素復染色，并用中性樹脂封片。封片完畢后將切片放置顯微鏡下觀察大鼠肺組織是否有充血水腫及肺組織間質間隙、肺泡和細支氣管情況等。

在小學數學教學中，創設教學情境是有效的教學方式之一，在整個課堂中，情境教學貫穿始末。合理的教學情境能夠充分發揮其教學價值，引導學生更好的學習，就像德國學者所說：一把鹽巴放在人們面前，很難直接吞下。但是將其放入到菜中，則會使人品味到美味佳肴。只有將教學情境和教學內容有效結合，才能夠發揮作用。但是，在實際教學中，情境創設問題過多，則會給學生帶來很大的學習壓力，增加學生學習負擔。創設問題情境主要目的是挖掘問題，引導學生學習解決問題的方法，如果創設過大，那么就會使教學內容變得復雜，學生很難接受，久而久之，學生會對數學學習失去興趣，產生厭煩心理，對教學效率產生直接的影響[1]。

1.6 大鼠肺組織中的氧化應激指標測定

取右側肺葉，按照說明書制備10% 肺組織勻漿，檢測5組大鼠肺組織中的MDA和SOD等氧化應激相關指標。試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，按說明書進行檢測。

1.7 ELISA法檢測大鼠肺組織和血漿中的IL-6測定

應用ELISA法檢測試劑盒檢測5組大鼠血漿和肺組織中IL-6的含量，按說明書進行操作。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織大體和病理學情況

處死5組大鼠模型，取出其肺組織，可見A組對照組大鼠肺組織均勻，無明顯肺水腫表現，濕重無明顯增加。B，C，D三組可見大鼠肺組織水腫明顯，濕重明顯增加，與A組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。對4組大鼠模型肺組織行HE染色，顯示A組大鼠肺組織無明顯充血水腫，肺組織形態大致正常。B，C，D大鼠模型肺組織充血水腫，肺組織間質間隙、肺泡和細支氣管內充滿含有蛋白質的液體，肺泡內有透明膜形成。且D組大鼠肺組織充血水腫最為明顯(圖1-4)。而E組大鼠全肺組織水腫普遍較輕，未見明顯滲出液。HE染色顯示E組大鼠肺組織肺間質水腫及炎癥細胞浸潤程度顯著減輕，水腫液大多已吸收，肺泡內散在少量嗜伊紅液體(圖5)。

圖1 A組大鼠模型肺組織：肺泡結構完整，肺泡壁無水腫(HE×100)。Fig.1 Lung tissue of rats in group A： the alveolar structure was complete，and there was no edema in the alveolar wall (HE×100).

圖2 B組大鼠模型肺組織：肺充血水腫，肺間質間隙、肺泡細支氣管充滿蛋白液體(HE×40)。Fig.2 Lung tissue of rats in group B： pulmonary congestion and edema，interstitial spaces of lung，alveolar fluid (HE×40).

圖3 C組大鼠模型肺組織：肺充血水腫，肺間質間隙、肺泡細支氣管充滿蛋白液體(HE×10)。Fig.3 Lung tissue of rats in group C：Pulmonary congestion and edema，interstitial spaces of lung，alveolar fluid filled with protein(HE×10).

2.2 各組大鼠肺組織中MDA和SOD的變化

比較4組大鼠在急性缺氧不同時間其肺組織中MDA、SOD的變化，并與A組做對比，研究結果顯示，B組大鼠與A組對照組比較，肺組織中MDA升高、SOD降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，隨著肺水腫時間的延長，C，D組大鼠在缺氧48 h和72 h后肺組織中MDA、SOD和A組相比變化明顯，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。經過激素治療后，E組和D組相比，肺組織中MDA降低、SOD升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 D組大鼠模型肺組織：肺間質明顯充血、水腫、增厚、炎性細胞浸潤，肺泡腔內滲出物(HE×20)。Fig.4 Lung tissue of rats in group D：Obvious congestion，edema，thickening，inflammatory cell infiltration and alveolar effusion(HE×20).

圖5 E組大鼠模型肺組織：肺間質水腫及炎癥細胞浸潤程度顯著減輕。Fig.5 Lung tissue of rats in group E：The degree of edema and inflammatory cell infiltration in lung significantly reduced.

表1 5組大鼠肺組織中SOD和MDA的變化Tab.1 Changes of SOD and MDA in lung tissue of rats

表2 4組大鼠肺組織和血漿中IL-6的變化Tab.2 Changes of IL-6 in lung tissue and plasma of rats

2.3 各組大鼠血漿和肺組織IL-6 變化

比較3組大鼠在急性缺氧導致肺水腫不同時間其肺組織和血漿中IL-6的變化，并與A組進行比較。結果顯示，B，C，D組大鼠血漿中的IL-6和A組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，B組大鼠與A組對照組比較，肺組織中IL-6有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，隨著肺水腫時間的延長，C，D組大鼠肺組織中的IL-6和A組相比升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。經過激素治療后，E組和D組相比，肺組織中IL-6明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

急性肺水腫多發生于急性廣泛性心肌梗死、急性心肌炎等，嚴重高血壓、主動脈瓣狹窄或二尖瓣狹窄，感染性心內膜炎、心臟外傷等一系列疾病，其發病迅速，往往會造成心肺功能衰竭，患者致死率高[1，4]。近年來，急性肺水腫的發病率逐漸增高，對于急性肺水腫的患者，重視其的預防和治療，可明顯提高肺水腫患者的存活率，減少后遺癥并發癥，因而日益引起醫學界的重視[5]。

目前認為，急性缺氧造成的肺血管過度收縮、肺毛細血管通透性增加和肺泡對液體的清除能力降低是肺水腫發生的重要機制[6]。有研究顯示，急性缺氧可引起氧化應激，后者具有調節炎癥反應、減少肺組織NO合成釋放和降低肺Na+-K+ATP酶活力等多種生物學作用[7]。缺氧可改變氧自由基/一氧化氮平衡，能通過過氧化物的分解產物引起細胞損傷。因此，測定氧化應激反應中的重要指標：抗氧化酶SOD、脂質過氧化產物MDA 及IL-6 含量或活性可反映機體內脂質過氧化的程度，反映出細胞損傷的程度[8]。

SOD是生物體內重要的抗氧化酶，其具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。當機體自由基產生大幅激增時會很快引起氧化應激，并影響到蛋白質表達等調節、應答機制。在自由基的誘導及機體代償應激下，細胞或機體會誘導性地增強抗氧化能力，一般會出現一過性SOD水平增高現象[9]。急性肺水腫的患者由于氧化應激，肺組織中的SOD會明顯升高。由于肺組織中的炎癥反應和氧化應激，肺組織和血漿中的IL-6也會明顯升高[10]。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷，因此，通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及動植物的抗逆性[11]。這3種指標均可反映機體內過氧化的程度，反映出細胞損傷的程度。

在本研究中，我們比較了3組大鼠在急性缺氧不同時間其肺組織中MDA、SOD的變化，B組大鼠肺組織中MDA升高、SOD降低，隨著肺水腫時間的延長，C，D組大鼠在缺氧48、72h 后肺組織中MDA、SOD的變化更加明顯，同時，B，C，D組大鼠血漿中的IL-6和A組相比明顯升高，C，D組大鼠肺組織中的IL-6和A組相比升高明顯，差異有統計學意義。

為了觀察肺水腫經治療減輕后，MDA、SOD和IL-6等指標的變化。我們設計了E組大鼠接受激素尾靜脈注射治療。結果表明，經糖皮質激素治療后，和D組相比，E組大鼠肺組織水腫普遍較輕，HE染色顯示肺組織肺泡融合，間隔較小，水腫液大多已吸收，肺泡內僅散在少量嗜伊紅液體。大鼠肺組織和血漿中MDA和IL-6明顯下降、SOD升高，提示糖皮質激素對治療急性肺水腫明顯有效。可能的作用是改善毛細血管的通透性，減少滲出，隨著肺水腫的改善，MDA等分泌減少，同時因肺組織對MDA具清除作用，故MDA和IL-6明顯下降。

糖皮質激素-糖皮質激素受體(GC-GCR)為體內主要的抗炎因子，使多種炎性因子的表達受到抑制，起到抑制炎性反應的作用[12]。實驗結果顯示，糖皮質激素可抑制刺激性氣體所致肺水腫的炎癥反應，抑制IL-10、IL-6、IFN-a等炎性因子，早期給予外源性糖皮質激素，可有效增加其與GCR的結合，發揮抗炎效果，減少炎性因子的釋放[13-14]。同時，糖皮質激素治療對全血中SOD活力產生影響，因為在肺水腫時，SOD因對抗缺氧產生的氧自由基以及TXA2、ET等而消耗性減少，經激素治療后后炎癥減輕，SOD活力部分恢復，激素肺臟抗氧化能力增強[15]。

綜上所述，肺水腫大鼠肺組織抗氧化能力和相關抗氧化酶活力顯著降低，而MDA卻顯著增加，血漿及肺組織IL-6水平亦顯著增加，提示我們氧化應激誘導在急性肺水腫造成的肺組織損傷中可能起到了重要作用。本研究得出的結論提示我們同時檢測肺組織和血漿中MDA、SOD和IL-6等的改變對急性肺水腫、病情評估、指導用藥及預后提供重要指導，值得在臨床工作中普及應用。

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Study on SOD, MDA and IL-6 in a rat model of acute pulmonary edema

WANG Juan1, JIA He-lei1, JI Hong-liang2, REN Dong-dong1, LU Chang-qing1

(1.Emergency department of Henan University of traditional Chinese medicine, Henan 450002, China；2.Department of internal medicine，general hospital，Zheng Rong hospital，Zhengzhou 450002, China)

Objective To investigate Interleukin 6(IL-6)，superoxide dismutase (SOD)，malondialdehyde (MDA) in lung tissues of a rat acute pulmonary edema model induced by acute hypoxia. Methods 50 adult Wistar rats were randomly divided into group A (normal)，B ( acute pulmonary edema，hypoxia for 24 h)，C (acute pulmonary edema，hypoxia for 48h)，D(acute pulmonary edema，hypoxia for 72 h) and E (dexamethasone treatment，hypoxia for 72h). The model of acute pulmonary edema was established by intraperitoneal injection with 6% ammonium chloride. In group E, dexamethasone (6mg/kg) was injected in tail vein following intraperitoneal injection of 6% ammonium chloride. The rats were killed 24(group B), 48 (C) and 72 hours(D&E) later. Plasma was isolated and lungs were removed. MDA，SOD in lung tissues and IL-6 in plasma were analyzed by ELISA. Results The wet weight of lung tissues were significantly increased in group B, C and D compared to group A(P<0.05). The lung tissues of group A had no obvious congestion and edema，and the morphology of lung tissues was normal(P>0.05). Pulmonary edema，interstitial spaces and alveolar filled fluid can be seen in group B，C，D and transparent membrane formed within alveoli. The lung tissue congestion and edema in group D were the most obvious(P<0.05). The above changes obviously improved in group E. Compared with group A，MDA，IL-6 increased and SOD decreased in lung tissues of group C and D. Compared with group D, MDA was decreased and SOD was increased in lung tissues of group E and IL-6 was also decreased significantly in plasma(P<0.05). Conclusion The occurrence of acute pulmonary edema related to oxidative stress and decreased antioxidant capacity. Increased free radical is an important mechanism of pulmonary edema. SOD，MDA and IL-6 in the lung tissue may be indexes for the prognosis.

Acute pulmonary edema;Rat model;Malondialdehyde(MDA);Superoxide dismulase(SOD);Interleukin 6(IL-6)

王娟(1975-)，女，碩士生，講師研究方向：心腦血管疾病及急危重癥的救治。E-mail:m15138690803@163.com。

盧長青(1965-)，男，碩士，副教授，研究方向：心血管病及急危重癥的急救，急性心梗的介入治療。E-mail:lcq0217@163.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0038-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.007

2016-06-01