碳酸鹽礦化菌的篩選與其吸附和礦化Cd2+的特性

趙 越,姚 俊,*,王天齊,原志敏,姜新舒,王 飛,代云容(.北京科技大學能源與環境工程學院,

北京 100083；2.中國地質大學水資源與環境學院,北京 100083)

碳酸鹽礦化菌的篩選與其吸附和礦化Cd2+的特性

趙 越1,姚 俊1,2*,王天齊1,原志敏1,姜新舒1,王 飛1,代云容2(1.北京科技大學能源與環境工程學院,

北京 100083；2.中國地質大學水資源與環境學院,北京 100083)

從貴州省畢節市媽姑鎮礦區重金屬污染的土壤中篩選出5株碳酸鹽礦化菌,探究其吸附和礦化Cd2+的特性.從代謝熱角度闡明Cd2+與基質(尿素)脅迫下菌活性會降低.實驗結果表明,2#菌株對Cd2+耐受能力可達250mg/L.菌株吸附和礦化效率隨Cd2+濃度增大而降低.Cd2+初始濃度為10mg/L時,菌齡為4h的菌株對Cd2+礦化效果最佳(45.14%),且礦化效果穩定.該研究表明碳酸鹽礦化菌通過誘導沉淀礦化去除Cd2+的效果優于菌體吸附,為碳酸鹽礦化菌修復重金屬污染提供理論參考和實踐指導.

碳酸鹽礦化菌；篩選；Cd2+；礦化；吸附

鎘(Cd)是典型的重金屬元素,其毒性是鉛的5倍以上.Cd可通過食物鏈進入人體,蓄積在肝腎之中,造成慢性不可逆的肝臟損傷,嚴重的將導致骨質疏松和軟化[1-2].Cd不能被徹底清除,在環境中滯留時間久,隨食物鏈在植物,動物和人體中不斷積累,這種永久性和積累性造成的潛在危害比表觀影響嚴重得多.近十年我國發生 Cd污染事件 60多起,市場上常見的市售大米約 10%存在Cd超標[3],已對我們的生存環境和身體健康產生了極大的威脅.因此從源頭控制 Cd污染,發展高效低廉的修復技術已經勢在必行.

眾多修復手段中生物修復以其成本低、無二次污染、高效等受到廣泛的關注.有研究表明,從Cd污染土壤中可以篩選出對 Cd具有高耐性的菌株,通過胞外沉淀和基團吸附固定 Pb,Cd可以取得良好的修復效果[4].向土壤中添加微生物,有機物料等,通過調節和改變土壤理化性質,在微生物作用下,可以改變重金屬離子的賦存狀態,抑制其生物有效性,減少毒害達到修復重金屬污染土壤的目的[5-6].Cd不是植物生長發育的必需元素,會對植物造成不良影響,如植株矮小,葉片退綠,生長遲緩,產量下降甚至死亡等[7],因而植物修復Cd污染受到環境的諸多限制.而微生物適應性較強,耐受Cd能力高,適用于大面積,低濃度的污染區域修復[8].目前微生物修復重金屬污染的機理主要包括對重金屬的吸附,沉淀,氧化-還原等作用[9],對微生物修復重金屬的研究熱點主要集中在微生物對重金屬的吸附作用,特性和機理方面,微生物作為吸附劑對重金屬的吸附作用機制有很多,其中包括離子交換,絡合作用,胞內富存,氧化還原等,探究手段也日趨成熟.

然而,針對微生物誘導礦化技術修復 Cd污染的研究相對匱乏.誘導礦化是生物地球化學循環的一個基礎部分,是指生物體通過生物大分子的調控生成無機礦物的過程.其中碳酸鹽礦化是生物礦化的一個重要方面,它是指菌株可以產生脲酶,分解環境中的基質(尿素)生成 CO32-,在微生物的控制或影響下,將溶液中的重金屬離子轉變為碳酸鹽固相礦物的過程.國外有研究已經證實利用微生物誘導碳酸鹽沉淀(MICP)技術可以有效地對放射性元素,微量元素 Sr,As()Ⅲ等污染進行礦化修復[10-11],形成的金屬礦物耐酸性強,重金屬離子得到有效的固定[12].而國內針對微生物誘導碳酸鹽成礦修復重金屬污染的研究還較少.礦山的開采,冶煉是我國 Cd污染的主要人為原因之一,礦區周邊土壤重金屬污染嚴重,但也是巨大的Cd耐受微生物資源庫.

本研究從貴州礦區重金屬污染農田土壤中篩選出碳酸鹽礦化菌,分別進行 Cd的菌體吸附及生物礦化實驗.研究菌株在基質和 Cd的脅迫下的微生物活性變化,探討不同因素(Cd濃度,基質,菌齡)對Cd去除效果的影響,為碳酸鹽礦化菌修復礦區Cd污染的工業化應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源 供試土壤采集于貴州省畢節市媽姑鎮農田(104.5618°E, 26.9744oN,海拔1965m),該地區鉛鋅冶煉歷史悠久,土法冶金產生的廢氣,廢水,廢渣的肆意排放與堆存導致該地區土壤重金屬污染嚴重.土壤pH值為6.32,全Cd含量 4.36mg/kg,是《土壤環境質量標準》(GB 15618—2008)[13]中二級標準限值(0.3mg/kg)的14倍多.

1.1.2 主要試劑 使用 CdCl2·5/2H2O(分析純,天津市光復科技發展有限公司)配制濃度為20g/L的 Cd2+儲備溶液,其他濃度 Cd2+溶液使用蒸餾水稀釋得到.尿素為分析純試劑,購自汕頭西隴化工有限公司.

1.1.3 培養基 1) 選擇培養基(g/L):酵母提取物10,氯化銨20,無水乙酸鈉8.2,尿素40.4,去離子水.尿素,氯化銨采用過濾滅菌,其余成分 121 ,℃高壓滅菌20min.

2) 鑒別培養基(g/L):蛋白胨 10,牛肉膏 3,尿素40.4,氯化鈉5,瓊脂粉15,1.6%溴甲酚紫2,去離子水.尿素與溴甲酚紫溶液采用過濾滅菌,其余成分 121 ,℃ 高壓滅菌 20min.最終使用 2mol/L NaOH溶液調節培養基pH值為5.75.

3) LB培養基(g/L):蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5.121℃高壓滅菌20min.

所有培養基在使用前均做滅菌處理.

1.2 實驗方法

1.2.1 碳酸鹽礦化菌的篩選和分離純化 將1g土壤樣品接種到滅菌的選擇培養基中,在 35 ,℃150r/min條件下振蕩培養 24h,用無菌水梯度稀釋至合適菌液濃度,涂布至鑒別培養基,35℃靜置培養 48h.挑取菌落特征明顯不同的且培養基周圍變紫色的菌株進行劃線分離,此步驟反復3次,進行純化,直至獲得純凈單菌.

1.2.2 菌株Cd2+抗性實驗 使用 LB液體培養基法分別考察菌株在存在和不存在基質(尿素)條件下對 Cd2+的耐受能力.將上步分離純化后的菌株接種至LB培養基中活化,在35℃,150r/min條件下振蕩培養24h后,按照1%接種量接種于含Cd2+濃度分別為 0,5,50,100,150,200,250,300, 400mg/L(不含或含 40.4g/L 基質)的 LB培養基中,在35℃,150r/min條件下振蕩培養48h,觀測菌株生長狀況.采用不添加Cd2+的培養基作為對照實驗,每個濃度設置3組平行實驗.

1.2.3 基質和 Cd2+對菌株代謝活性的影響 使用十二通道微量熱儀(TAMIII Multi-channel Thermal Activity Monitor, 美國TA儀器)通過測定熱功率-時間曲線來研究基質和Cd2+對菌株活性的影響.將純化后的菌株接種至 LB培養基活化 12h,用移液槍將 1mL 含有適宜濃度基質和Cd2+的 LB培養基加入到安瓿瓶中,取活化后的菌液按 1%的量接種到安瓿瓶中,用布擦拭干凈后放入微量熱儀通道中,在28℃下測定.

分別考察不同濃度 Cd2+和基質對菌株活性的影響.Cd2+對菌株活性影響的濃度選擇分別為10,20,30,40,50mg/L.基質對菌株活性影響的濃度選擇分別為 10.1,20.2,40.4,80.8,121.2g/L.Cd2+和基質聯合作用對菌株活性影響的濃度選擇為Cd2+10mg/L,基質濃度與上述濃度相同.

熱力學參數包括最大熱功率 Pmax;Tmax表示從微生物開始生長到最大功率時所用的時間;k表示微生物生長速率常數,k通過以下公式計算:

式中:t為時間;Pt為t時刻的功率,μW;P0為對數生長期開始時的功率,μW.

1.2.4 菌株吸附和礦化 Cd2+實驗 菌株在 LB培養基35℃,150r/min振蕩條件下培養24h后,使用離心機在4℃,3000r/min下離心10min,將收集到的菌體用蒸餾水洗滌三次,以排除培養基中有機物成分的影響,制成均勻的菌懸液后備用.菌株吸附Cd2+實驗中,將菌懸液加入到不同濃度Cd2+初始溶液中,使菌懸液最終濃度為 2g/L(以濕菌計).在 35℃,150r/min振蕩反應 3h后,立即在4℃,8000r/min下離心 10min,使用原子吸收光譜儀(SHIMAZU AAS6300, Japan)測定上清液中剩余 Cd2+濃度.菌株礦化實驗需在吸附試驗所有Cd2+溶液中添加適宜濃度的基質,其余操作條件與上述一致,所有實驗重復三次,兩組實驗中未添加菌體的溶液作為空白對照實驗.

Cd2+的去除效率計算公式如下:

式中:R為 Cd2+的去除效率;C0表示溶液的初始Cd2+濃度mg/L;Ce表示上清液中殘余的Cd2+濃度mg/L.

1.2.5 各因素(菌齡,基質濃度,Cd2+濃度)對菌株吸附,礦化 Cd2+效果的影響 1) 菌齡:將活化好菌株以 1%接種于 LB培養基中,分別在培養4,8,16,24,48h時,于4℃,3000r/min下離心10min,收集菌體,制備菌懸液,進行吸附和礦化實驗,Cd2+的初始濃度分別設置為 10,50mg/L,基質初始濃度為40.4g/L.

2) 基質濃度:本實驗擬考察基質濃度對菌株礦化 Cd2+能力的影響,設置初始溶液中基質濃度分別 10.1,20.2,40.4,80.8,121.2g/L,Cd2+濃度為10mg/L,進行菌株礦化實驗.

3) 初始 Cd2+濃度:探究初始 Cd2+濃度對菌株去除Cd2+的影響,初始Cd2+濃度設置為10,20, 30,40,50mg/L,礦化實驗中基質濃度為40.4g/L.

三組實驗中,除特殊提到的實驗操作,其余條件步驟同2.2.4.

2 結果與分析

2.1 碳酸鹽礦化菌的篩選與抗Cd2+能力

溴甲酚紫是一種酸堿指示劑,在酸性環境中呈黃色,堿性環境中呈紫色,含有溴甲酚紫的選擇培養基(pH=5.75)呈現青色.當碳酸鹽礦化菌成活,會因分泌脲酶將尿素分解為(NH4)2CO3,使菌落周圍選擇培養基 pH值升高,而呈現紫色.根據選擇培養基顏色變化(青色變為紫色)和多次分離篩選,得到5株菌落形態明顯不同的碳酸鹽礦化菌,分別編號為2#,7#,8#,9#,15#.

5株碳酸鹽礦化菌篩選自 Cd2+含量超標的礦區農田土壤中,該地區菌株經過長時間 Cd2+馴化作用,對Cd2+有一定耐受能力.抗Cd2+能力實驗結果見表 1,實驗結果證明 5株碳酸鹽礦化菌對Cd2+均有耐受能力,其中2#菌株對Cd2+耐受能力最強,在LB液體培養基中耐受能力為250mg/L,在含有基質的 LB液體培養基中耐受能力達到200mg/L.培養基中的尿素與 Cd2+的聯合作用對菌株的生長代謝產生一定的毒害作用,且分解尿素后培養基pH值由7.1升高至9,形成了不利于菌株新陳代謝的生長環境,導致含有基質的培養基中2#菌對Cd2+耐受能力減小[14].

根據前期實驗研究,2#菌株生長迅速,生物量大,經過 16S rDNA鑒定為某種芽孢桿菌(GenBank登錄號:KU870701).其對Cd2+耐受能力強,更容易適應惡劣的Cd2+污染環境,在Cd2+污染的修復中有很大實用意義,因此對2#碳酸鹽礦化菌吸附,礦化Cd2+的能力做了進一步分析.

表1 5株碳酸鹽礦化菌對鎘耐受情況Table 1 Carbonate-biomineralization microbial tolerance to cadmium

2.2 微量熱技術分析 Cd2+,尿素脅迫下 2#菌株代謝活性

圖1 Cd2+和基質脅迫下2#菌株的代謝功率—時間曲線Fig.1 Power-time curves of 2# bacterial strain afteradding Cd2+and urea

微量熱技術是近年來興起的一種實時、原位、無破壞的研究生物代謝熱的方法,其可以連續準確地監測和記錄微生物生長過程的反應熱且與微生物種類和代謝類型無關,能夠在相對真實的情況下反應微生物的活性.本實驗中不同濃度 Cd2+脅迫下,2#菌株代謝熱曲線如圖 1a所示.結果表明,隨著Cd2+濃度增大,菌株代謝活性降低,菌株生長速率常數k(表2)呈緩慢下降的趨勢.這說明在10～50mg/L范圍內,Cd2+濃度增大對菌株新陳代謝產生了輕微抑制作用.代謝熱的峰值降低是由于菌株利用其抵抗 Cd2+毒性的能力取代了傳統的生理功能[15],從而適應環境得以生存.

碳酸鹽礦化菌用于修復 Cd2+污染時,受到Cd2+與基質的共同作用,因此研究 Cd2+與基質共同脅迫下菌株的生長活性具有重要意義.根據菌株代謝的功率-時間曲線特征參數(表 2),Cd2+濃度保持在 10mg/L,基質濃度逐漸增大時,生長速率常數k出現明顯下降趨勢.基質存在時,出現最大功率峰值的時間逐步推遲,且基質濃度逐漸增大,曲線變得平緩(圖1b),菌株停滯期時間明顯增長,最大功率顯著降低,說明在復合體系下,基質濃度增大反而會抑制2#菌株的代謝活性.

表2 2#菌株代謝功率-時間曲線特征參數Table 2 Calorimetric parameters of 2# bacterial strain in the period of logarithmic phase at 28℃

2.3 不同因素對菌株吸附,礦化Cd2+的影響

2.3.1 菌齡的影響 如圖2所示,在Cd2+濃度為10mg/L時,隨培養時間的增長,2#菌株對 Cd2+吸附效率有明顯下降趨勢,最高去除效率發生在培養 4h的菌體上,該階段的菌體處于對數生長期,新陳代謝旺盛,脲酶活性高,吸附重金屬的活性基團基本形成.隨著菌齡增大,菌體新晨代謝減慢,吸附 Cd2+活力下降,使得吸附效率降低.菌株對Cd2+的礦化效率隨菌齡增大趨于穩定,菌體對Cd2+進行吸附的同時進行礦化作用,增強了 Cd2+的去除效率.

圖2 菌齡對菌株吸附、礦化去除鎘效率的影響Fig.2 Effects of cell age on the Cd2+removal efficiencyby biosorption and biomineralization

在 50mg/L Cd2+環境中,菌體吸附表現出相同的規律,但是菌體礦化 Cd2+效率曲線的趨勢與在低濃度Cd2+中明顯不同.菌齡較小時,礦化效率很低,菌體礦化Cd2+效率隨菌齡增大顯著提高.這是因為菌齡較小的菌體受50mg/L Cd2+與尿素影響大,菌體活性大幅度降低;而菌齡較大的菌體發育完整,在 50mg/L Cd2+與基質共同脅迫下耐受能力更強,脲酶活性穩定,使礦化效果受環境影響較小.但是菌齡為48h的菌株已達到衰亡期,培養48h后培養基中的生物量明顯降低,為了得到相同的生物量需耗費更多時間及成本,從實際應用角度考慮成本過高,所以沒有驗證菌齡超過 48h的菌株對Cd的去除率.

2.3.2 Cd2+濃度的影響 由圖3可以看出,隨著Cd2+濃度增高,菌株對 Cd2+的去除效率呈下降趨勢,該趨勢與許多研究結果均一致[16].Cd2+濃度為10mg/L時,菌株對其的吸附,礦化效率均達到最高,分別為 42.08%,53.06%.這是由兩方面原因造成的:一是菌體在低濃度的 Cd2+溶液中,大部分Cd2+有機會與菌體上吸附點位結合,而 Cd2+濃度增大導致菌體上吸附點位達到飽和,吸附率因此降低.另一方面,由于高濃度Cd2+影響微生物的吸附結構[17-18],降低菌體活性,使得活細胞數量減少. Cd2+可與菌體細胞表面的酶結合,通過菌體的主動運輸轉移到菌體內部,這一過程需要細胞代謝提供能量[19-20].從 3.2中不同 Cd2+濃度下菌株的時間-功率曲線可知,高濃度 Cd2+抑制菌體正常新陳代謝,使能量提供受到阻礙,去除效率因而降低.而菌體礦化過程,需要活菌體產生脲酶,Cd2+脅迫下脲酶活性降低[21],且活菌體的減少直接對成礦過程產生不利影響,導致礦化效率的降低.

菌體通過靜電吸引,螯合作用等吸附溶液中Cd2+,碳酸鹽礦化菌水解基質產生的 CO32-會在菌體表面與Cd2+結合形成CdCO3,菌體表面的功能基團可以有效地調節礦物與菌體表面的粘附力[22],微生物分泌物的刺激促進了CdCO3晶體的沉降[23].從圖 3可以看出,無論哪種初始濃度下,菌株通過誘導沉淀礦化去除 Cd2+效果均優于菌體吸附.與由此可見,碳酸鹽礦化菌用于Cd2+污染的修復蘊藏著巨大的潛力.

圖3 Cd2+初始濃度對2#菌株吸附、礦化效率的影響Fig.3 Effects of initial Cd2+concentration on the removal rate by biosorption and biomineralization

2.3.3 基質濃度的影響 由圖4可以看出:隨基質濃度增大,Cd2+去除效率出現先升高后降低的趨勢,在濃度為 40.4g/L時達到最大去除效率45.14%.基質濃度較低時,菌株礦化效率與吸附效率相差不多,這是由于低濃度基質對于菌株活性影響不大,但是低濃度的尿素經過微生物酶解作用產生的 CO32-濃度小,不利于 Cd2+礦物的結晶過程.基質濃度超過最適宜礦化濃度時,Cd2+去除效率明顯下降,甚至低于吸附效率.這是因為高濃度基質與 Cd2+的共同作用抑制菌株正常生長代謝,脲酶活性變低,嚴重降低礦化能力,能量代謝受到阻礙,主動運輸 Cd2+能力減弱.而且,溶液中尿素分解產生的銨根濃度增大,會與 Cd2+競爭吸附菌體上的吸附點位[24].

圖4 基質濃度對2#菌株吸附、礦化Cd2+效率的影響Fig.4 Effects of urea concentration on the Cd2+removal efficiency by biosorption and biomineralization

3 結論

3.1 在貴州礦區農田土壤中篩選出5株碳酸鹽礦化菌,其中 2#菌株對 Cd2+耐受能力最強.且Cd2+和基質濃度越大,對該菌株活性的抑制作用越強.

3.2 各因素對 Cd2+去除率的影響實驗結果表明:Cd2+濃度為10mg/L時,對數期的菌體對Cd2+去除效率達到最高;基質濃度為 40.4g/L時,2#菌株對Cd2+礦化效率最佳.

3.3 該實驗研究結果證明,2#菌株礦化去除Cd2+效率普遍高于菌體吸附作用.說明利用碳酸鹽礦化菌誘導碳酸鹽沉淀去除 Cd2+污染是一種很有前景的修復技術.

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Screening of carbonate-biomineralization microbe and its cadmium removal characteristics based on adsorption and biomineralization.

ZHAO Yue1, YAO Jun1,2*, WANG Tian-qi1, YUAN Zhi-min1, JIANG Xin-shu1, WANG Fei1, DAI Yun-rong2, (1.School of Energy and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；2.School of Water Resouces and Environment, China University of Geosciences (Beijing), Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2016,36(12)：3800～3806

Five carbonate-biomineralization microbes were isolated from a mine soil, which was from Magu town of Bijie city, Guizhou province, China. The removal ability of 2# bacterial strain for Cd2+was evaluated on the basis of biosorption and biomineralization. Experimental results showed that 2# strain had the strongest cadmium (Cd) tolerance in LB medium (250mg/L) among the five strains. The power-time growth curves indicated that the urea and Cd2+inhibited the growth of 2# strain. Both the biosorption and biomineralization efficiencies declined with the increasing concentration of Cd2+. The strain had the best Cd2+removal efficiency (45.14%) at its cell age of 4h. These results illustrated that the carbonate-biomineralization bacteria had a higher Cd2+removal efficiency by biomineralization than that by biosorption. This study will offer a theoretical reference and practical guidance for remediating the heavy metal-polluted environments.

carbonate-biomineralization microbe；screening；Cd2+；biomineralization；adsorption

X172

A

1000-6923(2016)12-3800-07

趙 越(1992-),女,河北衡水人,北京科技大學碩士研究生,主要研究內容:碳酸鹽礦化菌的篩選及礦化重金屬的研究.

2016-04-15

國家自然科學基金重點項目(41430106);國家自然科學基金(41273092,U1402234);環境保護部公益項目(201509049)

* 責任作者, 教授, yaojun@ustb.edu.cn