中藥穴位敷貼對實驗性乳腺增生模型大鼠雌、孕激素受體表達的影響

白東艷，易瑋，李艷慧，王澍欣，劉暢，廖穆熙

（1.廣州中醫藥大學針灸康復臨床醫學院，廣東廣州510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州510405）

中藥穴位敷貼對實驗性乳腺增生模型大鼠雌、孕激素受體表達的影響

白東艷1，易瑋1，李艷慧2，王澍欣2，劉暢1，廖穆熙2

（1.廣州中醫藥大學針灸康復臨床醫學院，廣東廣州510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州510405）

【目的】探討中藥穴位敷貼療法對實驗性乳腺增生模型大鼠的作用機制。【方法】將30只SD（遠交群）大鼠隨機分為正常組、模型組、穴位敷貼組，每組10只。采用雌激素誘導法復制大鼠實驗性乳腺增生模型，以中藥穴位敷貼治療。采用免疫組織化學染色方法，觀察各組大鼠乳腺組織細胞中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）的分布或含量。【結果】與正常組比較，模型組ER、PR表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，穴位敷貼組ER、PR表達水平顯著降低（P＜0.01）。【結論】中藥穴位敷貼療法可能通過下調乳腺組織ER、PR表達，從而起到抑制乳腺增生的作用。

乳腺增生；中藥穴位敷貼；雌激素受體；孕激素受體；疾病模型，動物；大鼠

乳腺增生屬中醫“乳癖”范疇。中藥穴位敷貼療法屬中醫外治法，是以中醫理論為指導，應用中草藥制劑施于腧穴的治病方法。經臨床驗證，中藥穴位敷貼療法用于乳腺增生病治療，療效確切[1-2]。為進一步探討中藥穴位敷貼治療乳腺增生的作用機理，本研究擬觀察其對實驗性乳腺增生模型大鼠雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠30只，清潔級，雌性，未孕，體質量（200±20）g，鼠齡3個月，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2003-001。

1.2 試劑與儀器己烯雌酚注射液，由上海通用藥業股份有限公司出品，國藥準字H31021403，批號：050101；黃體酮注射液，廣州明興制藥廠出品，國藥準字H31021401，批號：041102；ER抗體（BA0345，兔多抗，1∶100）、PR抗體（BA0107，兔多抗，1∶100）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。BMK-D500型數碼光學顯微鏡，由重慶奧特光學有限公司生產。

1.3 實驗藥物穴位敷貼藥物由本課題組自制。將冰片與三棱、莪術、天南星按質量比1∶3∶3∶3研成粉末，加甘油調成糊狀，制成膏，恒溫保存，待用。

1.4 實驗分組及造模將大鼠按體質量隨機分為3組（N=10）：正常組、模型組、穴位敷貼組，苦味酸標記。常規喂養，適應性喂養1周后造模。正常組每天注射生理鹽水0.2 mL/只，連續30 d。其他2組參考黃月玲等[3]的造模方法，在大鼠大腿內側肌肉注射己烯雌酚注射液0.5 mg·kg-1·d-1，連續25 d后，改用肌肉注射黃體酮注射液4 mg·kg-1·d-1，連續5 d。

1.5 干預方法造模成功后，正常組和模型組以蒸餾水灌胃，2 mL/次，每天1次，連續28 d。穴位敷貼組每天給予穴位敷貼治療6～8 h，連續28 d，具體方法：應用硫化鋇將大鼠中下腹部（相當于關元、氣海穴）脫毛，脫毛面積約為2 cm×4 cm，將大小約1 cm×1 cm、厚0.5 cm的藥膏，以紗布做襯，用膠布敷貼固定于氣海、關元穴及乳房局部阿是穴上。3組大鼠均予同等條件喂養，實驗結束后處死。

1.6 標本采集及指標觀察處死大鼠后，取乳腺組織，以體積分數為10%的甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片。采用免疫組織化學染色方法，觀察各組大鼠乳腺組織細胞中ER、PR分布和陽性表達強度。

免疫組織化學反應結果判定標準：參照文獻[4]。乳腺組織細胞核內出現棕色顆粒的細胞即為ER或PR陽性表達細胞。高倍鏡下每例隨機選取10個視野，共計數1 000個細胞，計算得出陽性細胞所占百分數。根據顯色強度和陽性細胞數2項指標來綜合判定ER或PR陽性表達強度：顯色淺、陽性細胞數＜25%者為“+”；顯色較淺、陽性細胞數介于25%～50%者為“++”；顯色較深、陽性細胞數介于50%～75%者為“+++”；顯色深、陽性細胞數＞75%者為“++++”。并將+、++、++++、++++、分別計為1、2、3、4分。

1.7 統計方法應用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理。3組ER、PR蛋白表達強度比較，采用Kruskal Wallis秩和檢驗，若組間差異有統計學意義，則采用兩獨立樣本的秩和檢驗進行組間兩兩比較。3組ER、PR蛋白表達強度計分均值以均數±標準差表示，組間經K-S檢驗，服從正態分布，經Levene檢驗，若方差齊，采用方差分析，若組間差異有統計學意義，應用LSD法進行兩兩比較；方差不齊，采用Dunnett’s T3法。

2 結果

圖1～2結果顯示：正常組乳腺腺泡上皮僅有少量細胞核呈棕色著色；模型組增生的腺泡上皮細胞核著色加深；穴位敷貼組腺泡上皮細胞核著色較模型組變淺。

表1結果顯示：正常組ER、PR陽性表達強度多在+～++，模型組多在+++～++++，穴位敷貼組多在++～+++。模型組ER、PR陽性表達強度與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；穴位敷貼組ER表達與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而穴位敷貼組PR表達與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表2結果顯示：與正常組比較，模型組ER、PR表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，穴位敷貼組ER、PR表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠乳腺組織ER表達（免疫組織化學法，×200）Figure 1Comparison of ER expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

圖2 各組大鼠乳腺組織PR表達（免疫組織化學法，×200）Figure 2Comparison of PR expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表1 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達強度比較Table 1Comparison of ER and PR expression intensity in rat mammary gland tissues of various groupsn/例

3 討論

3.1 穴位敷貼藥物處方及選穴依據

敷貼藥物選用天南星、三棱、莪術、冰片4種中藥。天南星化痰散結、消腫止痛，外用善治癰疽、痰核腫痛；三棱、莪術功專破血行氣、消積止痛；冰片辛香走竄，清熱止痛，又能通諸竅、散郁結。四藥外用，共奏行氣活血、消積止痛之功。本研究參考靳三針療法中“陽三針”的配穴方法，選用關元穴、氣海穴及乳房局部阿是穴。關元穴、氣海穴均為任脈之穴，任脈與女性生長發育和生殖關系密切。關元穴又為足三陰、足陽明、任脈的交會穴，主一身元氣；氣海穴為臍下“丹田”，“主一切氣疾”，兩穴可通調沖脈、任脈、足三陰經的氣血，舒暢氣機、培補元氣。乳腺增生屬本虛標實之證，以肝腎不足、沖任失調為本，氣滯、痰凝、血瘀為標。本中藥穴位敷貼法針對乳腺增生的病機特點，調沖任以固本培元，行氣活血以消腫止痛，標本兼顧，已被證實運用于臨床治療乳腺增生病患者有良好的療效[4]。本課題組既往研究[5]亦表明，穴位敷貼法干預乳腺增生模型大鼠后乳腺組織結構與模型組比較，乳腺導管上皮排列基本規則，導管管腔未見明顯擴大。

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達強度計分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR蛋白表達強度計分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組穴位敷貼組N 10 10 10 ER 1.5±0.53 3.5±0.71①2.6±0.52②PR 1.5±0.53 3.7±0.42①2.4±0.70②

3.2 ER、PR與乳腺增生病

乳腺增生病屬內分泌障礙性疾病。若雌激素分泌過多、孕激素相對減少，可導致乳腺組織在增生和復舊的周期性過程中發生病理性改變，引起乳腺末梢導管上皮呈不規則增生、導管擴張和囊腫形成，發生乳腺實質增生[6]。ER、PR是可以與雌激素、孕激素特異性結合的蛋白質，雌、孕激素的水平是否正常直接影響ER、PR的表達情況。病理狀態時，雌二醇（E2）與細胞內ER亞型ERα結合后激活轉錄，促使乳腺細胞線粒體數量顯著增多[7]。當乳腺細胞線粒體過度表達時，自身功能障礙隨之產生[8]，可誘導乳腺上皮及間質纖維增生[9]，降低細胞自身修復能力，還可促進ER和PR的合成，使乳腺上皮對雌激素的敏感性增加[10]。另外，E2和ER異常升高時，可引起PR亞型PR-A過度表達，使乳腺組織增生細胞的黏附力下降，誘導乳腺細胞發生形態改變；PR-A可激活特異性生長因子，致使乳腺上皮細胞對孕激素應答紊亂，不能由增殖轉入復舊[11]。研究表明，正常乳腺導管和小葉上皮細胞存在ER和PR，其數量因乳腺分化程度而異；良性乳腺疾病的腫塊組織ER和PR陽性率高于正常組織，但低于惡性腫瘤[12]。研究[12]表明，臨床患者乳腺增生病理組織中ER、PR呈高表達；SD大鼠乳腺增生模型研究結果發現模型組ER、PR陽性強度及表達數量隨乳腺增生程度加重而增加[9]。

本研究結果顯示，大鼠乳腺組織增生程度越明顯，其ER及PR積分值也越高，ER、PR表達也越強，與臨床試驗病理結果[13]一致。中藥穴位敷貼療法能抑制雌激素過度刺激所致的大鼠乳腺上皮增生，其機制可能是通過降低乳腺組織ER、PR含量，使乳腺組織對雌激素的敏感性下降，從而減弱雌激素在靶細胞上的生物學效應，產生抑制和治療乳腺增生作用。提示按照受體—受體病—受體調控模式，研究中醫藥對乳腺增生病的干預機制，針對性更強，更有利于提高臨床研究效能。

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［13］龔東方，陸智華，鄺幸華.針刺和中藥對乳腺增生的抑制作用研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2003，20（3）：216.

【責任編輯：黃玲，侯麗穎】

Effect of Chinese Medicine Point Application on Estrogen Receptor and Progesterone Receptor Expression in Experimental Rat Model with Hyperplasia of Mammary Glands

BAI Dongyan1，YI Wei1，LI Yanhui2，WANG Shuxin2，LIU Chang1，LIAO Muxi2
（1.Clinical Medical College ofAcupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.The First Clinical Medical College，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic mechanism of acupoint application of Chinese medicine for experimental rat model with hyperplasia of mammary glands.MethodsThirty Sprague Dawley rats were randomly divided into normal group，model group，and acupoint application group，10 rats in each group.Experimental model with hyperplasia of mammary glands was established by estrogen-induced method.The acupoint application of Chinese medicine was used for the treatment.The estrogen receptor（ER）and progesterone receptor（PR）expressionin mammary glands of various groups were determined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group，the levels of ER and PR expression were increased in the model group（P＜0.01）.Compared with the model group，the levels of ER and PR expression were decreased in the acupoint application group（P＜0.01）.ConclusionThe acupoint application of Chinese medicine has curative efficacy on hyperplasia of mammary glands，and its mechanism may be related with the down-regulation of ER and PR expression.

hyperplasia of mammary glands；Chinese medicine acupoint application；estrogen receptor（ER）；progesterone receptor（PR）；disease models，animal；rats

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0827-04

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.017

2016-06-21

白東艷（1974－），女，副教授；E-mail：bdyan203@gzucm.edu.cn

易瑋（1966-），女，教授；E-mail：yw8013@gzucm.edu.cn

廣州中醫藥大學青年教師科研創新基金項目（編號：06c026）