清燥救肺湯對結腸癌小鼠凋亡相關蛋白表達的影響

謝斌，謝雄，饒斌，劉紅寧

（江西中醫藥大學，江西南昌330004）

清燥救肺湯對結腸癌小鼠凋亡相關蛋白表達的影響

謝斌，謝雄，饒斌，劉紅寧

（江西中醫藥大學，江西南昌330004）

【目的】觀察清燥救肺湯對CT26結腸癌細胞增殖及凋亡相關蛋白如增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白表達，細胞外調節蛋白激酶（ERK）、Janus激酶1（JAK1）、信號傳導及轉錄激活因子1（STAT1）磷酸化蛋白表達的影響。【方法】50只雄性BALB/c小鼠，隨機分為模型組，化療組，清燥救肺湯高、中、低劑量組，每組10只。經小鼠右腋下注射CT26細胞以建立結腸癌模型。清燥救肺湯治療組于造模前2周即開始以15.2、7.6、3.8 g·kg-1·d-1劑量的清燥救肺湯灌胃給藥，化療組在造模完成后以5-氟尿嘧啶（5-FU）25 mg·kg-1劑量腹腔注射給藥（隔日1次），模型組以等體積生理鹽水灌胃給藥。2周后，處死各組小鼠，取瘤組織，稱瘤體質量并計算抑瘤率，Western blot法檢測p-ERK、PCNA蛋白表達，免疫組織化學法檢測p-JAK1、p-STAT1蛋白表達。【結果】清燥救肺湯高、中劑量組瘤體質量，p-ERK、p-JAK1蛋白表達顯著降低，p-STAT1蛋白表達顯著升高，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；清燥救肺湯高、中、低劑量組PCNA蛋白表達明顯降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。【結論】清燥救肺湯能顯著抑制荷CT26小鼠結腸癌細胞增殖，其機理可能與降低p-ERK、PCNA、p-JAK1及升高p-STAT1蛋白表達有關。

清燥救肺湯/藥理學；結腸癌/中藥療法；細胞外調節蛋白激酶；增殖細胞核抗原；Janus激酶1；信號傳導及轉錄激活因子1；疾病模型，動物；小鼠

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸腫瘤第3位[1]。結腸癌經臨床診斷時多已處于中晚期階段，治療上西醫以手術、放化療為主要方法，但患者生存期短，生活質量差。隨著中醫學對腫瘤疾病的不斷深入認識，中醫藥逐漸顯現出其獨具特色且安全有效的優勢。清燥救肺湯是益肺氣養肺陰的經典方，相關研究文獻[2-3]報道其具有顯著抗肺癌的作用。根據“肺與大腸相表里”理論，本研究選擇清燥救肺湯對結腸癌進行干預研究。為探討清燥救肺湯抗結腸癌的效果及藥理機制，本研究擬建立荷CT26結腸癌小鼠模型，觀察清燥救肺湯對結腸癌小鼠瘤質量、抑瘤率，增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白，細胞外調節蛋白激酶（ERK）、Janus激酶1（JAK1）、信號傳導及轉錄激活因子1（STAT1）磷酸化蛋白表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物和瘤株SPF級雄性BALB/c小鼠50只，體質量（20±2）g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2011-0003。小鼠CT26結腸癌細胞，購自美國ATCC公司，編號：CL-0071。

1.2 藥物及制備清燥救肺湯組成藥物：霜桑葉9 g、生石膏12 g、炙甘草3 g、黨參12 g、阿膠9 g、麥冬10 g、苦杏仁9 g、枇杷葉9 g，均購自江西省中醫院中藥房。將以上中藥加10倍量的清水浸泡1 h后，煎煮，水沸后以小火煎40 min，過濾；第2次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40 min，過濾；合并濾液，常壓濃縮至73 mL（即每毫升藥液含1 g原藥），冷卻后密封，4℃保存備用。清燥救肺湯高、中、低劑量分別為15.2、7.6、3.8 g·kg-1·d-1。藥量計算公式[4]：小鼠的劑量（g/kg）=人標準體質量（kg）×人的劑量（g/kg），中劑量相當于由人臨床劑量換算成的小鼠劑量。陽性藥物為注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，批號：SHD-2013-11-19-2916，美國Sigma公司），0.2 g/瓶，5-FU給藥濃度為25 mg·kg-1，隔日1次。

1.3 試劑和儀器胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程公司，批號：140409）；DMEM高糖培養基（美國Hyclon公司，批號：NZG1173）；抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒（丹麥Dako Denmark A/S公司，批號：K5007）；p-ERK一抗（批號：BS5016R，稀釋比1∶500）、PCNA一抗（批號：10205R，稀釋比1∶1 000）、p-JAK1一抗（批號：BS5085，稀釋比1∶100）、p-STAT1一抗（批號：AF3300，稀釋比1∶100）均由美國Bioworld公司提供；二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔（中國谷歌生物公司，批號：20140415）；β-actin（中國康為有限公司，批號：66009-1-AP，稀釋比1∶5 000）。DMI3000B倒置顯微鏡（德國LEICA公司）；RM2016切片機（上海徠卡儀器有限公司）；DGX-9003B烘箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；WD-9405A脫色搖床（北京六一儀器廠）；XSP-C204普通光學顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；PowerPacTW電泳儀及轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Fluor Chem M凝膠成像系統（美國PS公司）。

1.4 實驗方法將CT26結腸癌細胞置于37℃、5%（體積分數）CO2培養箱中，用含10%（體積分數）胎牛血清（FBS）的DMEM培養基貼壁培養。取最佳生長狀態的CT26結腸癌細胞，用無菌生理鹽水調節細胞密度至5×106個/mL。以0.2 mL/只（1×106個細胞/只）的接種量，于小鼠右腋下行皮下無菌接種。造模結束后，將小鼠隨機分為模型組，化療組，清燥救肺湯高、中、低劑量組，每組10只。模型組：接種24 h后，以0.2 mL生理鹽水灌胃，bid；化療組：接種24h后，5-FU以25mg·kg-1劑量隔日1次腹腔注射；清燥救肺湯高、中、低劑量組：造模前2周即開始按設計劑量灌胃給藥，bid，造模后繼續給藥2周。造模結束后，處死各組小鼠，取瘤組織，稱瘤體質量后做相關檢測。

1.5 指標測定

1.5.1 瘤體質量及抑瘤率處死各組小鼠取瘤組織，稱瘤體質量，取各組平均瘤體質量并計算抑瘤率：p平均抑瘤（%）=（m模型組-m治療組）/m模型組×100%。

1.5.2 Western blot法檢測p-ERK、PCNA蛋白的表達取適量結腸癌組織，加入適量含苯甲基磺酰氟（PMSF）及蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，放冰上裂解30 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液，105℃變性5 min。蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白電轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。50 g/L脫脂奶粉封閉，加入一抗p-ERK（1∶500）或PCNA（1∶1 000），4℃過夜，洗膜后加入二抗，室溫反應1 h，洗膜后進行化學發光，顯影，定影。孵育內參：以β-actin為內參，一般在同一張膜上孵育內參，與β-actin分子量相近的目的蛋白要做2張上樣量相同的膜或用膜再生液洗滌后再重新封閉，孵育內參（β-actin：脫脂牛奶封閉液=1∶1000），步驟同上。蛋白半定量圖像分析：采用凝膠成像系統Fluor Chem M圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度值（BC Average），以目的蛋白的光密度值與相應的β-actin光密度值的比值反映目的蛋白半定量表達水平。

1.5.3 免疫組織化學法檢測結腸癌組織p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達將組織切片脫蠟，水化，洗滌，抗原修復，洗滌，滅活酶，洗滌，以5%（體積分數）牛血清白蛋白封閉，加入一抗p-JAK1（1∶100）或p-STAT1（1∶100），4℃過夜孵育14 h；第2日室溫復溫3 h后，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，二氨基聯苯胺顯色；漂洗，蘇木素復染，貼片，脫水，中性樹膠封片。以LEICA倒置顯微鏡拍照，每張標本按順序選5個視野，Image-Pro Plus6.0分析，用平均光密度（D）表示陽性物質的相對含量。

1.6 統計方法采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析（ANOVA）方法進行組間的比較；計數資料計算率，組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 清燥救肺湯對荷CT26小鼠結腸癌瘤體質量及抑瘤率的影響表1結果顯示：與模型組比較，各治療組均能顯著降低荷瘤小鼠瘤體質量（P＜0.01）；各治療組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。該結果表明清燥救肺湯能抑制CT26小鼠結腸癌細胞的生長。化療組及清燥救肺湯高、中、低劑量組抑瘤率分別為83.90%、60.98%、44.39%、21.46%，4組抑瘤率差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌組織p-ERK、PCNA蛋白表達的影響表2、圖1結果顯示：除清燥救肺湯低劑量組，其他3個治療組均能顯著抑制p-ERK蛋白表達，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；清燥救肺湯高劑量組p-ERK蛋白水平低于中劑量組（P＜0.05），而與化療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明清燥救肺湯高、中劑量組通過降低結腸癌p-ERK蛋白表達而起到促進結腸癌凋亡的作用，且高劑量比中劑量作用強。

表1 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌小鼠瘤體質量及抑瘤率的影響Table 1Effect of DLD on tumor mass and tumor-inhibition rate of CT26 colon cancer-bearing mice

各治療組均可降低PCNA蛋白的表達水平，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；清燥救肺湯高劑量組PCNA水平低于化療組，差異有統計學意義（P＜0.05）。表明清燥救肺湯組和化療組均可通過降低結腸癌PCNA蛋白的表達促進結腸癌細胞凋亡，但清燥救肺湯降低作用不如5-FU。

表2 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌小鼠p-ERK及PCNA蛋白表達的影響Table 2Effect of DLD on p-ERK and PCNA protein expression in CT26 colon cancer-bearing mice，p）

表2 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌小鼠p-ERK及PCNA蛋白表達的影響Table 2Effect of DLD on p-ERK and PCNA protein expression in CT26 colon cancer-bearing mice，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較；③P＜0.05，與化療組比較；④P＜0.05，與清燥救肺湯高劑量組比較

組別模型組化療組清燥救肺湯高劑量組清燥救肺湯中劑量組清燥救肺湯低劑量組N 10 10 10 10 10 p-ERK/β-actin 0.923±0.040 0.618±0.142②0.623±0.044②0.770±0.084①③④0.818±0.020 PCNA/β-actin 0.857±0.186 0.556±0.080①0.269±0.159②③0.382±0.136②0.462±0.105②

2.3 清燥救肺湯對荷CT26小鼠結腸癌組織p-JAK1及p-STAT1蛋白表達的影響表3、圖2顯示：除清燥救肺湯低劑量組，其他3個治療組均能顯著抑制p-JAK1蛋白表達，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），但3個治療組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明清燥救肺湯高、中劑量組通過降低p-JAK1蛋白的表達促進結腸癌細胞凋亡。

圖1 各組小鼠結腸癌組織p-ERK、PCNA蛋白表達凝膠電泳圖Figure 1Gel electrophoresis results for p-ERK and PCNA protein expression in CT26 colon cancer-bearing mice of various groups

清燥救肺湯高、中劑量組可增強p-STAT1蛋白表達，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），但2組差異無統計學意義（P＞0.05）。表明清燥救肺湯高、中劑量組可通過升高p-STAT1蛋白的表達調控結腸癌細胞的凋亡。

表3 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌小鼠JAK1及STAT1蛋白磷酸化的影響Table 3 Effects of DLD on p-JAK1 and p-STAT1 protein expression in CT26 colon cancer-bearing mice，D）

表3 清燥救肺湯對荷CT26結腸癌小鼠JAK1及STAT1蛋白磷酸化的影響Table 3 Effects of DLD on p-JAK1 and p-STAT1 protein expression in CT26 colon cancer-bearing mice，D）

①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較

組別模型組化療組清燥救肺湯高劑量組清燥救肺湯中劑量組清燥救肺湯低劑量組N 10 10 10 10 10 p-JAK1 0.207 9±0.026 7 0.166 4±0.046 6②0.163 3±0.032 2②0.176 0±0.031 2①0.199 8±0.031 8 p-STAT1 0.136 6±0.017 0 0.124 2±0.015 5 0.168 4±0.009 5②0.160 7±0.018 0②0.149 8±0.020 5

3 討論

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，全球每年新發病例約120萬，年死亡例數約60.8萬[5]。在腫瘤治療方面，中醫藥具有減毒增效、提高帶瘤生存質量的獨特優勢[6]，故探求高效、低毒、經濟的中醫治療方法一直是中醫科研工作者們致力于腫瘤治療的方向。

清燥救肺湯是清代名醫喻嘉言清熱潤燥治法的代表方，主治燥熱傷肺重癥，臨床上常用于肺癌的治療并仍為現代名老中醫所推崇[7-8]。雖然“肺與大腸相表里”為中醫經典理論，但至目前尚未見應用該方進行結腸癌治療的相關報道。因此，本研究首次嘗試將清燥救肺湯用于結腸癌小鼠的治療。結果發現，清燥救肺湯能夠有效抑制荷CT26細胞結腸癌小鼠瘤體的生長。可見，將清燥救肺湯用于結腸癌的治療值得深入研究。基于此，本研究進一步探討了其治療結腸癌的藥理學機制。

圖2 各組小鼠結腸癌組織JAK1及STAT1蛋白磷酸化比較（免疫組織化學法，×400）Figure 2Comparison of phosphorylation of JAK1 and STAT1 protein in colon carcinoma tissues of mice（by immunohistochemistry，×400）

在腫瘤發生、發展過程中，ERK和JAK/STAT 2種信號轉導通路是調控腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及凋亡的重要途徑[9-10]。ERK是一類傳遞絲裂原信號的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活化后進入細胞核內，將細胞外刺激信號轉至細胞內，調控其下游一系列基因或蛋白的表達，從而調節著腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和侵襲轉移[11-14]。在該通路中PCNA受ERK調控，與細胞DNA合成蛋白關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態的良好指標[15]。故p-ERK和PCNA是反映結腸癌細胞增殖和凋亡的重要蛋白。JAK1的過表達、基因突變也與腫瘤發生、發展密切相關[16]。腫瘤細胞JAK1蛋白接受某種異常功能信號傳遞后發生磷酸化，被激活的JAK1繼而使下游蛋白STAT1發生磷酸化，活化的p-STAT1進入細胞核內，調控下游基因表達，從而起到調節細胞分化，促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長等作用[17-18]。由此可見，JAK/STAT通路中p-JAK1及p-STAT1亦是促進腫瘤凋亡的關鍵蛋白。故本研究通過觀察清燥救肺湯對結腸癌凋亡相關蛋白p-ERK、PCNA、p-JAK1及p-STAT1表達水平的影響，以期闡釋清燥救肺湯抗結腸癌的作用機理。結果顯示，清燥救肺高、中劑量組能顯著抑制p-ERK、PCNA、p-JAK1蛋白表達水平及升高p-STAT1蛋白表達，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明清燥救肺湯可能是通過抑制PCNA、p-ERK、p-JAK1蛋白表達及促進p-STAT1蛋白表達，促進細胞凋亡，從而發揮抗結腸癌的作用的。

綜上所述，運用中醫“肺與大腸相表里”理論，應用清燥救肺湯治療結腸癌小鼠可取得較好的效果，其作用機理可能與調控結腸癌凋亡相關蛋白p-ERK、PCNA、p-JAK1及p-STAT1的表達有關。本研究結果為后續進行清燥救肺湯的臨床研究初步奠定了實驗基礎。

［1］孫敬國，蔣曉忠，姚淑文，等.Twist蛋白表達與結腸癌發生發展的關系研究［J］.中國全科醫學，2011，4（14）：1311.

［2］鄧珊，胡兵，沈克平.大腸癌中醫病機與治療研究［J］.世界科學技術：中醫藥現代化，2012，14（4）：1858.

［3］謝雄，謝斌，饒斌，等.肺癌陰虛證型特點及補肺陰選方參考［J］.江西中醫藥大學學報，2015，27（6）：8.

［4］陳奇.中藥藥理學實驗［M］.上海：上海科學技術出版社，2002.

［5］喬冠英.祛瘀解毒法治療中晚期大腸癌的臨床研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2007.

［6］杜仲平，杜漸，王巧娥，等.帶瘤生存是中醫治癌的優勢所在［J］.長春中醫藥大學學報，2011，27（3）：407.

［7］武鵬鵬.張培宇主任中醫治療肺癌的經驗總結及思路探討［D］.北京：北京中醫藥大學，2015.

［8］顧恪波，王遜，何立麗，等.孫桂芝教授治療肺癌常用方劑淺析［J］.世界中西醫結合雜志，2013，8（2）：187.

［9］多玥荷，孫莉娜，應森林，等.西黃丸通過ERK/MAPK信號通路對人結腸癌裸鼠移植瘤的影響［J］.中華中醫藥雜志，2013，28（10）：3055.

［10］張國建，李猛，王天陽，等.去甲斑蝥素通過JAK-STAT3途徑誘導結腸癌LS-174T細胞凋亡［J］.腫瘤防治研究，2014，41（1）：16.

［11］Hoshino R，Chatani Y，Yamori T，et al.Constitutive activation of the 41-/43-kDa mitogen-activated protein kinase signaling path way in human tumors［J］.Oncogene，1999，18（3）：813.

［12］李晟，蔡琳，張楠，等.ERK蛋白磷酸化和肌成束蛋白Fascin-1與大腸癌侵襲轉移關系探討［J］.陜西醫學雜志，2015，40（10）：1295.

［13］王海英，彭瑞清，伍小軍.等.ERK蛋白磷酸化在局部晚期結腸癌的臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2010，35（10）：570.

［14］王祥宇，鄭燕，魯明.等.腫瘤代謝與腫瘤轉移［J］.復旦大學學報（醫學版），2016，43（1）：86.

［15］丁煥然，曹樹輝，馬立人.增殖細胞核抗原及其在肺癌中的研究進展［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2007，10（5）：492.

［16］李丹，李薇，劉念，等.JAK1在腫瘤發生和發展中作用的研究進展［J］.吉林醫學，2009，30（3）：279.

［17］妥少勇，竇長武，王宏偉，等.STAT1基因與腫瘤及其放療關系的研究進展［J］.臨床神經外科雜志，2015，12（5）：392.

［18］孔紅祥，王紅.CDK8、STAT1和TMEFF2在大腸組織中的表達及意義［J］.廣東醫學，2012，33（14）：2079.

【責任編輯：黃玲，侯麗穎】

Effect of Dryness-Clearing and Lung-Rescuing Decoction on Apoptosis-Related Proteins Expression in Mice of Colon Carcinoma

XIE Bin，XIE Xiong，RAO Bin，LIU Hongning
（Jiangxi UniversityofTraditional Chinese Medicine，Nanchang330004 Jiangxi，China）

ObjectiveTo observe the effect of Dryness-Clearing Lung-Rescuing Decoction（DLD）on the proliferation of CT26 colon cancer cells and on the expression of the cellular apoptosis-related proteins such as extracellular regulated protein kinase（ERK），proliferating cell nuclear antigen（PCNA），janus kinase 1（JAK1）and signal transducers and activators of transcription 1（STAT1）.MethodsFifty male BALB/c mice were randomly divided into model group，chemotherapy group，and high-，middle-and low-dose DLD groups，10 mice in each group.The colon cancer model was established by injection of CT26 cells into the right armpit.DLD groups were separately given intragastric administration of 15.2，7.6，3.8 g·kg-1·d-1of DLD two weeks before modeling.Chemotherapy group was given intraperitoneal injection of 25 mg·kg-1of 5-fluorouracil（5-FU）every two days after modeling.The model group was given intragastric administration of same volume of saline.After medication for 2 weeks，the mice were killed to obtain the tumor tissues for weighing tumor mass and calculating the tumor-inhibition rate.We determined the expression of phosphorylated-ERK（p-ERK）and PCNA by Western blotting method，and detected the expression of phosphorylated-JAK1（p-JAK1）and phosphorylated-STAT1（p-STAT1）by immunohistochemistry.ResultsThe tumor mass and the expression levels of p-ERK and p-JAK1 proteins of high-and middle-dose DLD groups were decreased，while the expression level of p-STAT1 protein was increased，the differences being significant compared with those of the model group（P＜0.05 or P＜0.01）. The expression level of PCNA protein was significantly lower in high-，middle-and low-dose DLD groups than that of the model group，the differences being significant（P＜0.01）.ConclusionDLD can significantly inhibit the proliferation of colon cancer cells，and its mechanism may be related with the down-regulation of p-ERK，PCNA and p-JAK1 protein expression，and with the up-regulation of p-STAT1 protein expression.

Dryness-Clearing Lung-Rescuing Decoction/pharmacology；colon cancer/TCD therapy；extracellular regulated protein kinase（ERK）；proliferating cell nuclear antigen（PCNA）；janus kinase 1（JAK1）；signal transducers and activators of transcription 1（STAT1）；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0835-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.019

2016-06-21

謝斌（1975-），男，副教授；E-mail：331080826@qq.com

劉紅寧（1957-），男，教授，博士研究生導師；E-mail：lhn0791@139.com

國家自然科學基金資助項目（編號：81260523）；江西省教育廳科技項目（編號：GJJ150833）；江西省研究生創新基金項目（編號：YC2015-S351）