異丙腎上腺素誘導的心功能不全中自噬的變化

白 燕 徐文麗 呂婷婷 武 燁 王 麗 王 雯 馬新亮 劉慧榮

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；2.代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京100069；3.山西醫科大學病理教研室，太原 030001)

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· 心血管疾病的病理生理機制 ·

異丙腎上腺素誘導的心功能不全中自噬的變化

白 燕1,2徐文麗1,2呂婷婷1,2武 燁1,2王 麗3王 雯1,2馬新亮1*劉慧榮2*

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；2.代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京100069；3.山西醫科大學病理教研室，太原 030001)

目的 探討在異丙腎上腺素誘導的心功能不全中自噬的變化。方法 用異丙腎上腺素腹腔注射法建立小鼠心功能不全模型；小動物超聲影像系統檢測心功能指標射血分數(ejection fraction, EF)、左室縮短率(fractional short, FS)、舒張早期充盈峰值/房縮期充盈峰值(ratio of early peak flow velocity and atrium peak flow velocity，E/A)和室間隔厚度(interventricular septum,IVS)的變化；尾壓法間接檢測血流動力學指標——心率(heart rate, HR)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)和平均動脈壓(mean blood pressure, MBP)的變化；心質量體質量比法即心臟質量(heart weight, HW)/體質量(body weight, BW)檢測心臟質量指數的變化；Western blotting印跡法檢測心臟組織中自噬標志物LC3、p62的變化。結果 與對照組相比，異丙腎上腺素模型組在4周后，小鼠心功能下降，EF下降、FS下降、IVS增加，差異具有統計學意義；同時模型組小鼠HR和DBP低于對照組，差異具有統計學意義；心臟質量指數指標(HW/BW)顯示模型組較對照組增高；自噬標志物檢測顯示，異丙腎上腺素注射1 d和3 d后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p62蛋白的相對量降低；連續注射4周后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與p62蛋白的相對量恢復至對照組水平。結論 異丙腎上腺素誘導的心功能不全過程中，心肌自噬早期升高，晚期恢復至正常水平。

異丙腎上腺素；心功能不全；自噬

近年來我國心血管病的患病率和病死率逐年上升，心血管病已成為我國居民的首位死亡原因[1]。心功能不全是許多心血管疾病的終末或嚴重階段，其發病機制復雜，多種致病因素和病理生理改變都能誘導或加重心功能不全的發生、發展。其中交感神經系統的過度持續激活，被廣泛認為是介導心功能由代償階段進展為失代償階段的重要病理因素[2]，許多心功能不全的患者體內，都可檢測到血漿兒茶酚胺濃度升高，臨床上應用腎上腺素受體阻斷劑如美托洛爾、卡維地洛等，能夠有效地改善患者的臨床癥狀。自噬是生物體內的一種分解代謝途徑，生理情況下存在低水平的細胞自噬，其可以降解細胞內受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質、清除氧自由基等，維持細胞內環境的穩定[3]。有研究[4]顯示，在不同的心血管疾病中自噬水平不同，在同一疾病的不同階段也存在著自噬不足或自噬過度現象，提示自噬作為一種應激性反應，可能在心功能不全的過程中動態改變，發揮保護或損傷作用。本實驗旨在建立心功能不全的動物模型，觀察自噬在心肌組織中的時序性變化，為進一步研究自噬在心功能不全中的作用積累實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性BALB/c小鼠30只，8周，購自北京維通利華實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。實驗動物使用計劃和實驗方案均已通過首都醫科大學倫理委員會許可。

1.2 主要試劑

鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride, ISO)，購自美國Sigma公司；RIPA裂解液(C1053)購自北京普利萊公司，PMSF(P0100)購自北京索萊寶公司；兔源LC3單克隆抗體(12741S)、兔源p62單克隆抗體(D5E2)購自美國CST公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記(ZB-2305)、山羊抗兔IgG/辣根酶標記(ZB-2301)購自北京中杉金橋公司；Western blotting試劑購自北京普利萊公司。

1.3 主要儀器

小動物超聲儀Vevo2100(Visual Sonics公司, 加拿大)；鼠尾血壓儀(BP-98A, Softron Biotechnology公司, 日本)；凝膠成像系統(Bio-Rad公司, 美國)。

1.4 動物模型的建立

模型組采用ISO腹腔注射法，5μg/g溶解在300μL 0.9%(質量分數)的氯化鈉注射液中，每日1次，分為ISO給藥1天組(n=5)、3天組(n=5)、4周組(n=10)，斷頸處死小鼠，取其心臟放入液氮中凍存，用于后續實驗。對照組(n=10)采用同等方法注射等劑量 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。

1.5 心功能的檢測

兩組小鼠在4周末時，于1.5%(體積分數)異氟烷吸入麻醉，備皮，用超聲儀對小鼠心臟進行掃描，檢測指標有射血分數(ejection fraction, EF)、左室縮短率(fractional short, FS)、舒張早期充盈峰值/房縮期充盈峰值(ratio of early peak flow velocity and atrium peak flow velocity，E/A)和室間隔厚度(interventricular septum,IVS)，所有數據均測量3次并取其平均值。

1.6 血流動力學的檢測

為使小鼠適應測血壓(blood pressure,BP)過程，先預測5 d左右，待平穩后開始正式測量。首先進行尾套和儀器的測漏檢查，然后將小鼠放在專用鼠籠內，將尾套套在小鼠尾巴上，打開儀器，待小鼠狀態穩定且脈搏穩定后，開始測壓，在測壓過程中，可根據小鼠狀態適當測壓并記錄(>6次)：心率(heart rate, HR)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)和平均動脈壓(mean blood pressure, MBP)，取平均值作為該小鼠的最后血流動力學參數。

1.7 心臟質量指數的測定

用預冷的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液洗去心臟殘留血液，剪去周圍結締組織和血管，濾紙吸干水分，稱量心臟質量，心質量指數=心臟質量(heart weight，HW)/ 體質量(body weight，BW)

1.8 Western blotting法檢測自噬標志物

取-80 ℃凍存的心肌組織置于冰上，稱取適量組織，按1 mg組織∶10 μL的比例，加入RIPA與PMSF的混合物，機械勻漿，超聲破膜，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清。BCA法蛋白定量，取50 μg的蛋白加入上樣緩沖液, 100 ℃變性7 min ，SDS-PAGE凝膠電泳后, 電轉移至PVDF膜，5%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入相應的一抗4 ℃過夜、次日加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育2 h, TBST緩沖液洗滌6次，每次5 min，加入化學發光試劑后顯影攝像。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 ISO致心功能不全模型建立成功

4周末時檢測心功能指標，結果顯示，與對照組相比，ISO處理的模型組小鼠，EF降低(45.69±4.16vs34.20±3.37,P=0.066)；FS降低(22.63±2.36vs16.26±1.75,P=0.061)；IVS降低[(0.68±0.02)mmvs(0.59±0.01)mm,P=0.010]；E/A比值差異無統計學意義(3.19±0.52vs5.01±0.81,P=0.110)(圖1)，提示ISO連續腹腔注射法建立心功能不全小鼠模型成功。

2.2 ISO致模型組小鼠血流動力學異常

4周末時用尾壓法檢測血流動力學，結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠的HR降低 [(473.30±12.37) min-1vs(428.70±9.52) min-1,P=0.004]；DBP降低[(58.09±2.63) mmHgvs(49.31±2.82) mmHg,P=0.030]； SBP無顯著變化[(97.61±1.62) mmHgvs(101.00±4.09) mmHg,P=0.500]；MBP無明顯改變[(71.26±2.12) mmHgvs(66.54±2.77) mmHg,P=0.210]，進一步提示模型建立成功，用ISO模擬臨床上心功能不全的發病過程有效(圖2)。

圖1 4周末時，兩組小鼠各心功能指標變化比較

Fig.1 Cardiac function declined in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week

*P<0.05vsvehicle group,n=5. Cardiac function declined in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week. EF(A), FS(B) and IVS(D) decreased significantly; No significant change was observed in E/A(C) between two groups； ISO：isoprenaline hydrochloride； EF：ejection fraction； FS：fractional short；IVS：interventricular septum；E/A：ratio of early peak flow velocity and atrium peak flow velocity.

圖2 4周末時，兩組小鼠血流動力學變化

Fig.2 Abnormal hemodynamic changes were observed in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week

*P<0.05vsvehicle group,n=10. Abnormal hemodynamic changes were observed in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week. HR(A) and DBP(B) reduced in ISO group. No significant change was observed in SBP(C) and MBP(D) between two groups; ISO：isoprenaline hydrochloride；HR:heart rate;DBP:diastolic blood pressure;SBP:systolic blood pressure;MBP:mean blood pressure;△1 mmHg=0.133 kPa.

2.3 ISO致模型組小鼠心臟質量指數增加

4周末時，ISO處理組的心臟質量指數較對照組增高(0.005 518±0.000 195 9vs0.006 232±0.000 508 8,P=0.040)，提示ISO誘導心臟質量相對增加。

圖3 4周末時，兩組小鼠心臟質量指數比較

Fig.3 The ratio of HW/BW increased in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week

*P<0.05vsvehicle group,n=5. The ratio of HW/BW increased in ISO group compared with the vehicle group at the 4th week. ISO：isoprenaline hydrochloride； HW/BW：ratio of heart weight and body weight.

2.4 ISO致模型組小鼠心肌自噬水平異常

用Western blotting 法檢測自噬標志物LC3與p62的表達水平，結果顯示，ISO腹腔注射1 d后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值升高即LC3Ⅱ的轉化率增加(0.243 8±0.024 5vs0.366 1±0.041 2,P=0.030)，p62的相對表達量呈降低趨勢(0.299 0±0.068 0vs0.215 7±0.018 1,P=0.080)；ISO腹腔注射3 d后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值仍高于對照組水平(0.316 1±0.032 7vs0.422 9±0.043 1,P=0.080)，即LC3Ⅱ的轉化率增加，p62的相對表達量降低(2.599 0±1.037 0vs0.807 5±0.206 7,P=0.090)；ISO腹腔注射4周后，LC3Ⅱ的轉化率(0.301 1±0.042 8vs0.311 3±0.036 3,P=0.862)和p62的相對表達量(0.680 2±0.194 6vs0.629 1±0.158 3,P=0.845)恢復至對照組水平，提示ISO誘導心功能不全過程中，早期階段心肌自噬升高，隨著時間變化逐漸恢復至正常水平。

圖4 ISO刺激1 d(A)、3 d(B)和4周(C)后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與p62/βactin比值的變化

Fig.4 The ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰincreased and the relative protein expression of p62 decreased in ISO group compared with the control group at the 1th day(A)， 3th day(B) and 4th week(C)

*P<0.05,n=5. No significant change was observed between the two groups at the 4th week(C); ISO：isoprenaline hydrochloride.

3 討論

異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)可以非特異性的興奮心肌表面的β腎上腺素受體，激活cAMP系統，開放鈣通道，產生正性變力與變時效應，使心肌收縮加強，心率加快，致使心肌耗氧量增加，造成心肌彌漫性壞死，并逐漸進展為慢性心力衰竭[5]。這種心力衰竭模型在原發性給予ISO誘導心肌損傷后，因為沒有其他損傷因素(如瓣膜疾病、冠狀動脈結扎、病毒等)的持續存在，所以能夠更好地反映心力衰竭的自然病理過程[6]。ISO的持續注射可誘導心臟長期處于過度興奮狀態，與臨床上心功能不全初期，患者血漿中兒茶酚胺類物質增多，心功能處于代償階段的狀態相似。ISO持續作用4周后，射血分數和左室縮短率明顯降低，E/A比值升高，同時心率降低，舒張壓降低，與文獻[7-8]報道的ISO對心血管的作用相一致。目前建立動物心功能不全模型的方法主要有縮窄腹主動脈法、結扎冠狀動脈法、藥物誘導及快速起搏法等[9]，這些方法可以不同程度的引起心功能及血流動力學的改變，如EF、FS降低，E/A升高，HW/BW升高，HR降低等。本實驗通過注射異丙腎上腺素，成功誘導出了心功能的降低和血流動力學的異常，可以代表其他心功能不全的動物模型，且本方法操作簡便，可重復性好，安全有效，在實驗過程中未發生動物死亡。本實驗在ISO注射1 d和3 d時也進行了心功能和血流動力學的檢測，但與對照組相比無明顯改變，故數據未予以給出，分析原因可能是機體神經體液調節機制和多種血管活性物質的功能代償，而導致短期注射ISO引起的心血管效應被掩飾。

自噬是將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體內進行消化降解的過程[10]。自噬既是一種廣泛存在的正常生理過程，又是細胞對不良環境的一種防御機制，參與多種疾病的病理過程[11]，正常水平的自噬可以保護細胞免受環境刺激的影響，但自噬過度和自噬不足卻均可能導致疾病的發生。在多種心臟疾病中，均伴有心肌細胞自噬的改變，且影響著疾病的發生發展。在心力衰竭中，細胞自噬增強可導致心肌細胞自噬性死亡[12]；在心肌肥厚中，細胞自噬程度降低，加劇心肌肥厚；而在心肌梗死中，細胞自噬增強可減小梗死面積[13]，提示在不同的病理狀態下，自噬水平的增強或減弱，可以對疾病的發展和轉歸產生不同的效應，緩解或加重病程[14]。本實驗觀察到在ISO誘導的心功能不全模型中，心肌自噬水平異常：ISO注射1 d和3 d后，反映自噬水平的指標LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值升高、p62的相對表達量降低；但ISO持續注射4周后，心肌自噬水平又恢復至與對照組相同，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和p62的相對表達量在兩組之間差異無統計學意義，提示在ISO誘導心功能不全發展的4周時間窗內，心肌自噬經歷了先升高，最后恢復至正常水平的動態過程。心臟在ISO的刺激下，早期自噬升高可能是作為一種應激性保護反應，加速心肌細胞的分解代謝，清除損傷的蛋白和細胞器，清除氧自由基，提供能量，對心肌細胞發揮保護作用，但在ISO持續作用一段時間，誘發明顯的心功能不全后，心肌自噬卻恢復至正常水平。本實驗中，心功能不全發生時，這種與基礎生理狀態下差異無統計學意義的較低水平的自噬，對心肌細胞究竟是保護性還是損傷性作用，仍有待于進一步的研究[15-16]。本實驗仍然存在一些不足之處，如ISO誘發心血管疾病時，自噬由升高到恢復這個過程中，是否存在自噬水平的降低等許多問題仍有待深入探討。明確自噬的動態變化，需要進一步優化時間窗的設計，以捕捉到自噬水平由升到降發生變化的關鍵時間點。對心肌自噬動態變化的研究，將有利于從自噬的角度探討心臟疾病的發生發展機制[17]，確定自噬的動態變化是否與臨床上患者心功能狀態由代償階段進入失代償階段有著密切關系，由此開發出在心臟疾病的不同階段靶向調節自噬的治療藥物，豐富臨床上心功能不全患者的藥物治療手段。

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編輯 陳瑞芳

Change of autophagy in the isoprenaline-induced cardiac dysfunction

Bai Yan1,2, Xu Wenli1,2, Lyu Tingting1,2, Wu Ye1,2, Wang Li3, Wang Wen1,2, Ma Xinliang1*, Liu Huirong2*

(1.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.KeyLaboratoryofMetabolicDisordersRelatedCardiovascularDisease,Beijing100069,China; 3.DepartmentofPathology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Objective To observe the change of myocardial autophagy during the isoprenaline-induced mice cardiac dysfunction. Methods The mice model of cardiac dysfunction was established by intraperitoneal injection of isoprenaline persistently for 4 weeks. Cardiac function was monitored by ultrasonic imaging system; hemodynamic changes were measured via tail-cuff method; autophagy-related protein expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand p62 were detected by Western blotting. Results After treatment with isoprenaline for 4 weeks, ejection fraction and fractional short reduced, interventricular septum increased, the ratio of early peak flow velocity and atrium peak flow velocity (E/A) tended to be elevated, suggesting declined cardiac function in model group compared with control group. Correspondingly, the heart rate and diastolic blood pressure decreased in model group compared with control group. After the injection of isoprenaline for 1 day and 3 days, the level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰincreased and relative expression of p62 increased, but both returned to normal levels at the 4th week. Conclusion In the progress of isoprenaline-induced cardiac dysfunction, myocardial autophagy increased at an early stage, then returned to the normal level appearing to be a dynamic trend.

isoprenaline; cardiac dysfunction; autophagy

國家自然科學基金(31401006)，北京市自然科學基金重點項目(7151001)，973計劃前期研究專項(2014CB560704)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31401006), Natural Science Foundation of Beijing (7151001), 973 Special Preliminary Study Plan (2014CB560704).

時間：2016-12-14 20∶19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2019.028.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.001]

R 541

2016-10-03)

*Corresponding author， E-mail：xin.ma@jefferson.edu; liuhr2000@126.com