利用SPR檢測(cè)26肽與β1-腎上腺素受體自身抗體的相互作用

董 玉 呂婷婷 徐文麗 白 燕 武 燁 劉慧榮 王 雯

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

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· 心血管疾病的病理生理機(jī)制 ·

利用SPR檢測(cè)26肽與β1-腎上腺素受體自身抗體的相互作用

董 玉 呂婷婷 徐文麗 白 燕 武 燁 劉慧榮 王 雯*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

目的 探討根據(jù)β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)(β1-adrenergic receptor,β1-AR-ECⅡ)的氨基酸序列合成的26肽與β1-腎上腺素受體β1-AR-ECⅡ的單克隆抗體(β1-adrenergic receptor autoantibodies,β1-AA)的相互作用。方法 根據(jù)人β1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)(β1-AR-ECⅡ)的氨基酸序列合成26肽；采用雜交瘤細(xì)胞融合的方法獲得針對(duì)β1-AR-ECⅡ的單克隆抗體(β1-AA)；利用表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)檢測(cè)該合成的26肽與β1-AA的親和力；利用乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該合成26肽對(duì)β1-AA的中和作用。結(jié)果 提取的β1-AA可以使乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加(P<0.05)，提示該β1-AA具有生物學(xué)活性；合成26肽與β1-AA結(jié)合的親和力(KD)為4.44 μmol/L，屬于中等強(qiáng)度結(jié)合；較β1-AA組相比，26肽處理后可明顯降低心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率(P<0.05)。結(jié)論 該合成26肽與β1-腎上腺素受體自身抗體之間存在相互作用，并且可以拮抗β1-AA引起的乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率的增加。

β1-腎上腺素受體自身抗體; 26肽; 表面等離子共振

研究[1]顯示，多種心血管疾病患者血清中都存在針對(duì)β1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的自身抗體(β1-adrenergic receptor autoantibodies,β1-AA)，這提示免疫功能的紊亂可以加速心力衰竭進(jìn)程。以往研究[2-6]顯示，β1-腎上腺素受體自身抗體的長(zhǎng)期存在可以引起心功能下降、炎性反應(yīng)、心肌重塑以及心律失常等，參與心力衰竭事件的發(fā)生。

針對(duì)β1-AA引起的心力衰竭，中和抗體法已成為近年研究的熱點(diǎn)[7-9]。這種方法是基于合成特異性肽與β1-AA結(jié)合以消除其對(duì)心臟的有害刺激作用。β1-AA主要與β1-腎上腺素受體的細(xì)胞外第二環(huán)(β1-adrenergic receptor，β1-AR-ECⅡ)結(jié)合，β1-AR-ECⅡ由26個(gè)氨基酸構(gòu)成。然而該類肽與β1-AA的結(jié)合特征并不清楚，因此本課題根據(jù)人β1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列，應(yīng)用固相合成法合成26肽，通過(guò)表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)檢測(cè)該合成26肽與β1-AA之間的相互作用，觀察兩者相互結(jié)合的動(dòng)力學(xué)特征，同時(shí)應(yīng)用乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證26肽對(duì)β1-AA下游激動(dòng)效應(yīng)的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只SPF級(jí)健康雌性BalB/C小鼠，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g；15只SPF級(jí)健康SD大鼠的乳鼠，0～3 d，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶 1∶250(Trypsin Powder, Porcine 1∶250，Sigma公司，美國(guó))；Ⅱ型膠原酶(Collagenase type 2，Worthington公司，美國(guó))；美托洛爾(Metoprolol tartrate, Abcam公司，美國(guó)); 枸櫞酸鈉溶液(Sodium Acetate Buffer，pH 5.5)、HBS-EP運(yùn)行緩沖液以及甘氨酸鹽酸緩沖液(Glycine-HCl，pH 1.5)均購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)肽段的合成:根據(jù)人β1-AR-ECⅡ氨基酸序列，委托上海強(qiáng)耀生物科技有限公司采用固相合成多肽法合成26肽(HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC)，運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行純度檢測(cè)，純度大于98%。

2)單克隆抗體的制備:采用雜交瘤細(xì)胞融合的方法獲得分泌單克隆β1-AA的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選，選擇1株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，按照1×106/只接種BalB/C雌性小鼠，在第10～14天收集腹水，Protein G親和柱純化腹水進(jìn)行β1-AA單克隆抗體的提純，并用乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)提取β1-AA的功能。

3)表面等離子共振:運(yùn)用Biacore T200 (GE Healthcare)檢測(cè)26肽與β1-AA的相互作用。將β1-AA用pH為5.5的枸櫞酸鈉溶液稀釋成10 mmol/L，應(yīng)用胺偶聯(lián)試劑盒將β1-AA偶聯(lián)到CM5傳感芯片上，捕獲信號(hào)為2655RU。以HBS-EP作為儀器運(yùn)行緩沖液，將分析物(26肽)稀釋成6個(gè)濃度(0.437 5～14 μmol/L)，選定“Kinetics”程序進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度循環(huán)之后，芯片表面注入10 mmol/L pH值為1.5的Glycine-HCl運(yùn)行30 s以再生，循環(huán)完畢，獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)。一般認(rèn)為親和力(Affinity KD)為10-3mol/L時(shí)，兩者為弱結(jié)合，KD為10-6mol/L時(shí)為中等強(qiáng)度結(jié)合，KD為10-9mol/L時(shí)為強(qiáng)結(jié)合。

4)乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng):取正常SD大鼠0～3 d的乳鼠，用75%(體積分?jǐn)?shù)) 乙酸消毒后用剪刀從劍突左緣剪開胸骨，取出心臟置于冰冷PBS中充分清洗，眼科剪剪碎后吸入離心管，加入PBS，1 000 r/min, 離心5 min。棄掉PBS，加入1 mL酶混合液，置37 ℃水浴中搖動(dòng)消化3 min，將酶懸液吸出加入到含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基中終止消化，如此反復(fù)加酶混合液至組織消化完全。收集消化液與培養(yǎng)基混合液，1 000 r/min，離心5 min,加入新鮮培養(yǎng)基貼壁1.5 h后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到新的離心管中，1 000 r/min，離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 β1-AA能夠增加乳鼠心肌細(xì)胞的跳動(dòng)頻率

與Vehicle組相比，β1-AA組的心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率明顯升高[(125.33±11.678)min-1vs(101.23±13.205)min-1,P<0.05)]，提示其具有生物學(xué)活性，詳見圖1。

圖1 β1-AA使乳鼠心肌跳動(dòng)頻率增加

Fig.1 β1-AA increased the beating frequency of neonatal rat cardiomyocytes

β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibodies；*P<0.05vsvehicle group.

2.2 該合成26肽與β1-AA具有較強(qiáng)親和力

26肽與β1-AA以1∶1比例結(jié)合，pH=1.5的Glycine-HCl再生30 s，得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)：ka=7.34×103/m·s-1, kD=3.26×10-2/s, KD=4.44 μmol/L, Rmax=68.9 RU；該合成26肽與β1-AA有中等強(qiáng)度的結(jié)合(圖2)。

圖2 26肽與β1-AA結(jié)合的親和力

Fig.2 Binding affinity(KD) of the peptide and β1-AA

β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibodies.

2.3 26肽可降低β1-AA引起的乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加

β1-AA可引起乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加[(118.67±2.309)min-1vs(97.33±2.309)min-1,P<0.05]；與β1-AA組相比，用26肽處理后乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率顯著降低[(81.33±2.309)min-1vs(118.67±2.309)min-1,P<0.05]。該26肽能夠拮抗β1-AA引起的乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加，詳見圖3。

圖3 26肽處理可顯著降低β1-AA引起的乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加

Fig.3 Peptide decreased the beating frequency of neonatal rat cardiomyocytes induced by β1-AA(n=6)

β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibodies；*P<0.05vsvehicle group，#P<0.05vsβ1-AA group.

3 討論

本研究利用固相合成多肽法成功合成了模擬β1-AR-ECⅡ的26肽，采用雜交瘤細(xì)胞融合的方法獲得了針對(duì)β1-AR-ECⅡ的單克隆抗體，表面等離子共振的結(jié)果證實(shí)合成的26肽與β1-AA具有相互作用，且能夠拮抗其引起的下游類激動(dòng)劑樣效應(yīng)。

β1-AA激活β1-AR后，可啟動(dòng)G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(Gs-AC-cAMP-PKA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起cAMP升高、正性變時(shí)、變力、變傳導(dǎo)等類激動(dòng)劑樣效應(yīng)。在乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率實(shí)驗(yàn)中，β1-AA增加了心肌細(xì)胞的跳動(dòng)頻率，這與前期實(shí)驗(yàn)[3]結(jié)果一致；26肽處理后，心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率較β1-AA組下降。有研究[10]報(bào)道體外實(shí)驗(yàn)預(yù)孵育β1-AA后加入特異性肽可減弱受體信號(hào)、降低80%以上的β1-AA引起的cAMP的產(chǎn)生，大鼠注射此類肽24 h后明顯降低了cAMP的下游反應(yīng)[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)β1-AA合成的10肽可以延長(zhǎng)家兔心律失常時(shí)心房有效不應(yīng)期；另外，β1-AA陽(yáng)性心肌病大鼠長(zhǎng)期注射此類肽可以反轉(zhuǎn)心臟擴(kuò)張并且改善心功能[13]。近期，此類肽化合物在人體的臨床I期已完成[14]，結(jié)果表明模擬β1-AR-ECⅡ結(jié)構(gòu)合成的肽具有良好的耐受性和高度特異性且作用安全。以上結(jié)果提示，根據(jù)β1-AR-ECⅡ合成的此類肽可以拮抗β1-AA引起的下游有害效應(yīng)。

目前研究證實(shí)，此類肽可以緩解或反轉(zhuǎn)由β1-AA所致的心臟疾病，但未有文獻(xiàn)報(bào)道β1-AA與肽的直接作用。既然此類肽的臨床效果已初見成效，根據(jù)β1-AA的免疫原性特點(diǎn)，合成穩(wěn)定且無(wú)不良反應(yīng)的肽類藥物必將為臨床β1-AA所致的自身免疫疾病提供廣闊的治療前景。由此可見，闡明肽與β1-AA的分子間相互作用是未來(lái)藥物研發(fā)的必由之路。傳統(tǒng)研究分子間相互作用的方法有多種, 如酵母雙雜交、放射免疫分析、酶連結(jié)免疫分析、免疫共沉淀等方法，但操作耗時(shí)費(fèi)力、步驟繁瑣、需要標(biāo)記且假陽(yáng)性率高[15]。表面等離子共振可以實(shí)現(xiàn)無(wú)須標(biāo)記分子, 動(dòng)態(tài)監(jiān)控兩者結(jié)合與解離過(guò)程, 低樣品消耗以及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其原理是：通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)將β1-AA單克隆抗體固定在傳感器芯片上，當(dāng)分析物流過(guò)芯片表面時(shí)，通過(guò)免疫反應(yīng)與固定的抗體結(jié)合，引起芯片表面光學(xué)參數(shù)變化，這一變化與芯片表面結(jié)合的物質(zhì)的質(zhì)量有關(guān)[16-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用SPR技術(shù)，證實(shí)了合成26肽與β1-腎上腺素受體自身抗體之間直接相互作用的動(dòng)力學(xué)特征，得到其結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)以及親和力，乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，26肽中和β1-AA之后，其下游類激動(dòng)劑樣效應(yīng)明顯減弱。本研究為后續(xù)深入探索兩者之間作用的機(jī)制以及肽類藥物在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)提供了依據(jù)。

致謝:感謝首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心的楊穎老師在表面等離子共振檢測(cè)方面提供的技術(shù)支持和幫助。

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編輯 慕 萌

Detection of the interaction between the peptide and β1-adrenergic receptor autoantibodies using surface plasmon resonance

Dong Yu, Lyu Tingting, Xu Wenli, Bai Yan, Wu Ye, Liu Huirong, Wang Wen*

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofMetabolicDisordersRelatedCardiovascularDiseases,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To investigate the interaction between the peptide which mimic the structure of the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (β1-AR-ECⅡ) and β1-adrenergic receptor autoantibodies (β1-AA). Methods Peptide was synthesized according to the amino acid sequence of human β1-AR-ECⅡ; a hybridoma fusion method was used to obtain anti-β1-AR-ECⅡmonoclonal antibody; the interaction between the peptide and β1-AA was detected by surface plasmon resonance (SPR); and the beating frequency experiment of neonatal rat cardiomyocytes was explored to test the neutralization of the peptide to β1-AA. Results β1-AA enhanced the beating frequency of neonatal rat cardiomyocytes (P<0.05), indicating that the β1-AA we obtained has biological activity; SPR results showed that there was a moderate binding affinity (KD) of 4.44 μmol/L between the synthetic peptide and β1-AA. Conclusion There was interaction between the synthesized peptide and β1-adrenergic receptor autoantibodies.

β1-adrenergic receptor autoantibodies(β1-AA); 26 peptide; surface plasmon resonance

973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(2014CB560704)，北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(7151001)。This study was supported by 973 Special Preliminary Study Plan(2014CB560704), Natural Science Foundation of Beijing(7151001).

時(shí)間：2016-12-14 20∶19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2019.034.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.004]

R 971

2016-10-03)

*Corresponding author， E-mail：wangwen@ccmu.edu.cn