正交設計法探討橘皮多糖的提取

張星和+張珊珊

【摘要】用正交實驗法討論從橘皮中提取多糖的最佳實驗條件，探討了不同提取時間、酶解溫度、pH和料液比（酶用量）等條件對提取得率的影響，結果表明，在酶解時間75min，料液比1：60g/mL，酶解溫度45℃，pH為5.0時多糖的提取率最高。

【關鍵詞】酶法;橘皮;正交實驗設計

多糖又叫多聚糖（polysaceharides，Ps），是由多個相同或不相同的單糖以糖苷鍵相連而成的極性復雜大分子，分子量為數萬，數十萬到數百萬，甚至有的達上千萬。多糖有促進免疫調節、抗心肌缺血、抑制腫瘤、抗癌及降低血糖等生物活性。目前多糖的提取有熱水提醇沉法、水浸提法、酶解提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等。結合試驗室條件，試驗采用纖維素酶法對橘皮中的多糖進行提取，并以多糖得率為指標通過正交設計優選最佳提取工藝。

一、材料與方法

1、材料與設備

橘子購于保山集市，購回后將橘皮取下，洗凈，切小，將其置于陽光充足的地方曬干;纖維素酶（BR，30U/mg，上海博奧生物科技有限公司）;其他試劑均為分析純。

HH-S26s數顯恒溫水浴鍋;GUO HUA 800低數離心機;JH-14-07 A-14-07-161型可見分光光度計;DFT-200型手提式高速萬能粉碎機;DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱等。

2、多糖含量的測定

目前，多糖的測定方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，本實驗采用第二種方法，以干燥至恒重的葡萄糖為標準品。

3、橘皮多糖的制備

準確稱取過60目篩的橘皮若干于圓底燒瓶中，加少量蒸餾水浸泡24h，加入一定量的酶溶液并調pH值，放入恒溫水浴鍋中酶解一段時間后取出，離心得上清液。再將剩余沉淀重復酶解兩次，合并上清液。放入90℃的水浴鍋中滅活10min，冷卻。用80%乙醇沉淀，離心得粗多糖，待顯色后于490nm出測定吸光度A。

4、粗多糖提取率計算

多糖得率（%）=（多糖含量/原料重量）*100%

5、酶法提取的正交實驗

影響多糖提取率的因素很多，如酶的添加量，反應時間，反應溫度及其pH值。針對這些因素，采用四因素三水平的正交實驗確定橘皮多糖酶解法提取的最佳條件，具體參數見表1。

表1：因素水平表

二、結果與討論

1、葡萄糖標準曲線

由實驗得出的結果以葡萄糖濃度為橫坐標（x），吸光度（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線如圖1所示。

圖1：葡萄糖標準曲線

標準曲線回歸方程為y=0.5021x+0.0163，R2=0.994，線性關系良好。

2、酶法提取條件的優化

取樣品每份0.500g，按照L9（34）分9組實驗，得到的數據如表2所示。

表2：正交表和實驗分析結果

由直觀分析可知，RC>RA>RB>RD，四個影響多糖提取率的因素主次順序，分別是C>A>B>D，即酶的添加量>酶解溫度>pH>酶解時間，最佳參數為A2B2C3D2，即以料液比1：60，在pH為5.0的緩沖溶液中，回流提取75min，提取溫度定為45℃，反復提取三次，多糖提取率最高。按照最佳反應條件進行三次驗證實驗，結果橘皮多糖的提取率為27.10%，較最高5號樣26.94%略高。

三、結論

本文采用纖維素酶解新方法提取橘皮多糖，該工藝通過酶水解破壞植物細胞壁的作用，可以使細胞內的多糖物質充分溶出，從而顯著提高了橘皮多糖提取率。

為進一步優化酶解法提取多糖實驗條件，本實驗用L9（34）正交表考察了酶添加量（液料比）、酶解溫度酶解時間以及pH4個因素對提取率的影響。在最佳條件下，纖維素酶法提取橘皮多糖的提取率為27.10%。

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