中藥復方對ED大鼠海綿體Cx43的影響*

曲曉偉 尤耀東 張培海 李俊濤 常德貴

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中藥復方對ED大鼠海綿體Cx43的影響*

曲曉偉1尤耀東2張培海3李俊濤4常德貴5△

目的基于“肝藏”理論，從陰莖海綿體平滑肌縫隙鏈接蛋白Cx43角度研究疏肝養血法對肝郁血虛ED大鼠的干預作用。方法選取經交配后證實有正常勃起功能的雄性SD大鼠30只，隨機分為空白組、模型組、疏肝養血組，每組10只，采用尾部放血和懸吊激惹方法配合低鐵飲食制備肝郁血虛勃起功能障礙模型，給以四物湯與逍遙散合方煎劑灌胃14天，末次灌胃24小時后處死大鼠，取陰莖海綿體組織，HE染色觀察陰莖海綿體組織病理學變化，免疫組化SP法檢測陰莖海綿體Cx43表達。結果與空白組相比，模型組陰莖海綿體組織病理學改變不明顯，陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，疏肝養血組陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達顯著提高(P<0.05)。結論改善陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達可能是基于“肝藏”理論，疏肝養血法治療ED的物質基礎及作用機制之一。

“肝藏”理論；勃起功能障礙；疏肝養血；Cx43

性生活是夫妻生活的重要組成部分，是人類生存和繁衍的需要，男性勃起功能是影響性生活質量的重要因素[1]。研究顯示，大約有52%的40～70歲男性存在不同程度的勃起功能障礙(Erectile Dysfunction，ED)，不和諧的性生活嚴重影響著家庭和睦和社會穩定[2～4]。傳統醫學認為男性勃起多與腎有關，故治療也多從腎論證，但目前效果不盡人意。我們前期臨床實踐表明[5，6]，ED患者大多表現為肝腎功能失調，從肝論治多獲良效。實驗證明[7，8]，肝郁氣滯可致陰莖海綿體組織中5-磷酸二酯酶(PDE5)活性增強、一氧化氮合成酶(nNOS)活性下降，導致男性ED，而疏肝理氣活血中藥能逆轉這一過程，改善病情，但對具體機制尚未研究。故本課題基于“肝藏”理論，運用動物模型，從陰莖海綿體平滑肌中縫隙鏈接蛋白Cx43角度研究疏肝養血法對肝郁血虛ED大鼠的干預作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物2.5月齡性成熟SD大鼠45只，體質量370g～420g，雄性30只，雌性15只，由成都達碩生物科技有限公司提供，質量合格證號：scxk(川)2013-24。每只雄性大鼠均經交配后證實有正常勃起功能。實驗期間飼養于室溫(20±3.0)℃，相對濕度60%～70%，光照12h∶12h(光∶暗)，自由攝食全價大顆粒飼料，飲水，適應性馴養1周后使用。

1.1.2 主要試劑與設備甲醛(由成都市聯合化工試劑廠生產，批號：201210101)；蘇木素(由上海華申康復器材有限公司提供，批號：20120822)；CX43試劑盒(由博奧森生物技術有限公司提供，貨號：北京bs-8987R)；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(由北京中山金橋生物有限公司提供，ZB-2010.LotV0527)；生物素化山羊抗小鼠IgG(H+L)(由北京中山金橋生物有限公司提供，ZB-2020.LotV0522)；DAB(由北京中山金橋生物有限公司提供，Kit ZL1-9032 Lot753223A)；倒置顯微鏡(由日本OLYMPUS公司生產)；Motic BA400顯微攝像系統(由麥克奧迪公司生產)；Image-Pro Plus圖像分析系統(由Media Cybernetics，Inc.生產)。

1.1.3 實驗藥物白術、茯苓、柴胡、當歸、白芍、甘草、生姜、薄荷、熟地黃與川芎中藥材均購自成都同仁堂藥店，經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定，各藥材均符合《中國藥典》(2010版第一部)藥品相關項目檢查。四物湯、逍遙散參照《方劑學》教材確定劑量[9]，四物湯藥物組成與劑量如下：熟地黃12 g，當歸9 g，川芎6 g，白芍9 g；逍遙散藥物組成與劑量如下：柴胡15 g，當歸15 g，白術15 g，白芍15 g，茯苓15 g，炙甘草7.5 g，生姜3 g，薄荷3 g。四物湯與逍遙散合方根據上述劑量加合。分別按上述劑量配比稱取四物湯與逍遙散合方的藥材，置于溶器中，加8倍量水，浸泡30 min后，煎煮30 min，過濾，共煎2次，合并濾液，60℃水浴濃縮為1∶1(即每毫升藥液含原生藥1 g)藥液，4℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組選取雄性SD大鼠30只，數字表法隨機分為空白組、模型組、疏肝養血組，每組10只。

1.2.2 造模及給藥除空白組外，其余各組動物參照文獻[10～13]方法，采用尾部放血和懸吊激惹方法配合低鐵飲食制備肝郁血虛模型。具體操作方法如下：75%酒精消毒尾部后，手術刀在尾部橫向割開約3mm創口，擠壓放血2ml/只，常規消毒創面并包扎，隔2天1次，連續5次。放血后休息2h(當天如果沒有被動失血操作，則直接進行懸吊激惹)，將大鼠尾部綁縛在固定物上，使其懸空倒吊于20 cm 深，溫度為(20±2)℃的水面上，以大鼠前肢剛接觸水面為每只大鼠適宜的懸吊高度。同時用小木棍激惹大鼠，使其極度緊張與恐慌，而又無法發泄。懸吊激惹每天1次，連續14天，每次30 min，以后每2 天增加10 min。造模大鼠均飼喂低鐵飼料(配方：玉米淀粉54%，奶粉40%，豆油5%，食鹽1%)。造模的第1天開始，在懸吊結束后1 h，疏肝養血組動物給予灌胃四物湯與逍遙散合方煎劑12.96g/kg，空白組、模型組給予灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續14天。

1.2.3 標本取材末次給藥24 h后，大鼠脫頸椎處死，在下腹正中低位切口，迅速剖取大鼠的陰莖組織，并將其立即置于冰上，快速分離大鼠的陰莖海綿體組織，用冰冷生理鹽水中洗凈殘留血液后，置入10%中性甲醛溶液中固定供制作標本用。

1.2.4 觀察指標陰莖海綿體平滑肌組織病理學觀察將上述取材標本常規HE染色；檢測陰莖海綿體平滑肌Cx43的表達免疫組織化學S-P法可顯示組織和細胞中抗原分布，鏈霉親和素是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質，其分子量47000，對生物素分子具有極高的親和力，其親和力是一般抗原抗體的一百萬倍。親和素是一個堿性蛋白，經生物改造后可轉變成中性的蛋白質。免疫組織化學S-P法檢測步驟參照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 一般狀態觀察結果本實驗觀察發現，空白組大鼠活動正常，對外界刺激較為靈敏，毛發光亮。模型組大鼠反應遲鈍，少動萎靡，體毛暗淡無光澤。疏肝養血組大鼠與模型組大鼠比較，一般狀態均明顯改善。實驗過程中因動物撕咬、灌胃等因素致三組各脫落4例。

2.2 陰莖海綿體平滑肌病理學觀察各組大鼠陰莖海綿體平滑肌病理切片HE染色后置于光鏡下觀察，結果發現各組形態學改變不明顯。見圖1。

2.3 陰莖海綿體平滑肌Cx43表達Cx43呈棕黃色—黃色表達于細胞漿，陰性細胞核為藍色。與空白組相比，模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織Cx43積分光密度明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，疏肝養血組陰莖海綿體平滑肌組織Cx43積分光密度明顯增高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖1 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌病理學圖片(HE×100)

圖2 Cx43在陰莖海綿體平滑肌的表達(IHC×200)

表1 各組陰莖海綿體平滑肌Cx43積分光密度

表1 各組陰莖海綿體平滑肌Cx43積分光密度

組別樣本數CX43積分光密度空白組60.0561±0.0096模型組60.0209±0.00381)疏肝養血組60.0463±0.01142)

注：與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討論

中醫學認為肝與勃起功能關系密切，《沈氏尊生書》說：“失志之人，抑郁傷肝，肝木不能疏泄，亦致陽痿不起”。王氏在80年代初提出“陽痿從肝論治”理論，曾對中醫治療陽痿產生較大影響[14]。肝主疏泄，主司精神活動，肝之疏泄情志功能障礙，影響到宗筋功能的正常發揮，從而導致陽痿。“肝藏血，主疏泄”，“肝藏”是人體內調節物質流動和分布的功能系統，其生理解剖基礎是人體平滑肌系統[15]。血管以平滑肌為其結構主體，是“肝藏”貯藏和疏泄血液的結構基礎。陰莖海綿體組織由平滑肌細胞、血竇、竇內皮細胞、竇間隙等組成。其中，平滑肌細胞是陰莖海綿體的主要成分，血竇之間是富有平滑肌纖維的結締組織小梁，而血竇與其靜脈相連，當血液進入血竇后，竇間隙擴張，血液則充盈，陰莖發揮勃起功能。陰莖勃起和排精由平滑肌完成，是“肝行腎氣”的體現，而“肝行腎氣”的生理解剖基礎是生殖系統平滑肌，肝對性生理的調節是通過平滑肌系統而實現[16～18]。疏肝理氣活血之法，基于“肝藏血，主疏泄”的理論，使筋為肝主，氣血暢行，從而改善陰莖的血液循環，提高陰莖海綿體平滑肌充血灌注功能，以復陰莖之作強功能，從而達到治療ED的目的。

縫隙鏈接(Gap junction，GJ)是細胞之間的主要通訊方式之一。GJ是由連接相鄰兩個細胞間的連接通道排列而形成的一種特殊膜結構。相鄰的細胞之間通過GJ介導的細胞間通訊進行著信息、能量與物質的交換，參與細胞之間物質交換的代謝偶聯與電信號傳遞的電偶聯，對細胞內環境的穩定、增殖與分化等生理過程發揮重要的調控作用。陰莖海綿體平滑肌中含有大量縫隙鏈接蛋白Cx43，在海綿體收縮與舒張的協調性過程中起著關鍵作用，調節海綿體的舒縮，參與陰莖勃起的調控。Larson等于1990年首先報道了人類陰莖海綿體的血管內皮細胞能表達Cx43mRNA，其后有學者進一步證實了Cx43及其mRNA在陰莖海綿體平滑肌細胞的存在[19]。Cx43作為陰莖平滑肌組織主要的連接蛋白，將Ca2+轉運的信號從一個平滑肌細胞傳遞到另一個平滑肌細胞內，對于協調平滑肌細胞間的同步收縮和舒張有著十分重要的作用。李錚等[20]以6例具有正常勃起功能的正常人體海綿體組織作為對照，運用RT-PCR方法檢測了9例器質性ED患者陰莖海綿體組織中Cx43的表達，結果發現器質性ED患者陰莖海綿體組織中Cx43的表達量顯著低于正常對照組。

本實驗結果表明，肝郁血虛ED大鼠陰莖海綿體平滑肌Cx43表達明顯降低。通過逍遙散合四物湯干預后，Cx43表達明顯增高，表明疏肝養血法可通過養肝血使宗筋得養，疏肝氣而宗筋得控，從而調節陰莖的勃起功能。而改善Cx43表達可能是基于“肝藏”理論，疏肝養血法是治療ED的物質基礎及作用機制之一。

[1] 洪鍇，劉德風，姜輝，等.性生活質量影響因素及PDE5抑制劑治療勃起功能障礙后性生活質量改善的多中心臨床研究[J].中國性科學，2015，24(3)：3-6.

[2] Derby CAI， Araujo AB， Johannes CB， et a1. Measurement of erectile dysfunction in population-based studies：the llse of a single question self-assessment in the Massachusetts Male Aging study[J]. Int J lmpot Res，2000，12(4)：197-204.

[3] Yasusuke Kimoto， Koichi Nagao， Haruaki Sasaki， et al. Guidelines for erectile dysfunction[J]. International Journal of Urology，2008，15(7)：564-576.

[4] 張強，宋春生.中西醫結合治療勃起功能障礙的思路[J].中國中西醫結合雜志，2013，33(4)：541-543.

[5] 張蜀武，常德貴，李建亞.從肝論治陽萎臨床小結.附：40例病例報告[J].成都中醫藥大學學報，1999，19(3)：25-26.

[6] 于軍橋，張蜀武，張培海.益坎膠囊對肝氣郁結型勃起功能障礙患者的臨床研究[J].中國實用醫藥，2012，7(2)：174-175.

[7] 常德貴，王崢屹，祝彼得，等.疏肝理氣活血法對肝郁氣滯大鼠陰莖海綿體PDE5活性影響的實驗研究[J].中華男科學雜志，2004，10(1)：71-73.

[8] 常德貴，王崢屹，祝彼得，等.疏肝理氣活血法對肝郁氣滯大鼠陰莖海綿體NOS活性影響的實驗研究[J].中國男科學雜志，2004，18(3)：14-16.

[9] 鄧中甲.方劑學[M].2版.北京：中國中醫藥出版社，2010：84-85，156-158.

[10] 苗明三，方曉艷，孫艷紅.血虛動物模型復制的思考[J].光明中醫，2003，18(3)：8-9.

[11] 王秋林，王樹人，王久源，等.肝郁陽痿模型制作[J].中國男科學雜志，2005，19(2)：24-27.

[12] 許敏，方肇勤.血虛證動物模型造模方法與評析[J].上海中醫藥大學學報，2006，20(3)：73-76.

[13] 張蜀武，曲曉偉，王秋林，等.益坎膠囊對肝氣郁結模型大鼠性活動影響的實驗研究[J].現代中西醫結合雜志，2007，16(9)：1171-1173.

[14] 王琦，洪德華.論陽痿從肝治[J].天津中醫，1985(5)：151.

[15] 田進文，石巧榮，韓君.論肝藏的生理解剖基礎是人體平滑肌系統[J].山東中醫藥大學學報，1997，21(1)：7-12.

[16] 田進文，韓成仁，王士雯.論血管平滑肌系統是中醫肝貯藏和疏泄血液的生理解剖基礎[J].中醫雜志，2004，45(6)：408-409.

[17] 田進文，石巧榮，韓成仁，等.論平滑肌是肝藏調節性生理的解剖基礎[J].安徽中醫學院學報，2004，24(5)：1-3.

[18] 田進文，石巧榮.論平滑肌系統是疏泄功能的形態學基礎[J].湖南中醫學院學報，2004，24(3)：21-23.

[19] Larson DM，Haudensehild CC，Beyer EC.GaP junetion messenger RNA expression by Vascular rwall cells[J].CireRes，1990，66(4)：1074-1080.

[20] 李錚，蔣健航，張賢生，等.勃起障礙者陰莖海綿體Cx43和nNOSmRNA的表達[J].上海第二醫科大學學報，2005，25(4)：399-423.

《中國中醫藥現代遠程教育》雜志征訂征稿啟事

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Effect of Traditional Chinese Medicine Compound on Cx43 in Penis Smooth Muscle of SD Rats

QU Xiaowei1YOU Yaodong2ZHANG Peihai3LI Juntao CHANG Degui5△

(1.Department of Urology, Zhengzhou People's Hospital, Henan, Zhengzhou 450003, China;2.Department of Andrology,The First Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610072, China;3.Department of Andrology, Sichuan Hospital of Combined of Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan,Chengdu 610041, China;4.Department of Andrology, The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Henan, Zhengzhou 450008, China;5.Department of Andrology, The Second Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610041, China)

Objective To observe the effect of dispersing liver and nourishing blood treatment on Cx43 in penis smooth muscle of SD rats with the liver-stagnation and blood-deficiency erectile dysfunction based on the guidance of “Gancang” theory. Methods 30 normal erectile function sexually mature male SD rats which confirmed by mating with female rats were randomly divided into blank group, model group and dispersing liver and nourishing blood group, with 10 rats in each group, meanwhile they were fed with low-iron diet to establish the liver-stagnation and blood-deficiency ED models. After 14 days intragastric administration with Siwu decoction and Xiaoyaosan decoction, all were killed after last gavage 24 hours with taking the sponge meristem to pathological observation with HE and the expression of Cx43 with SP. Results We found that the pathological changes of sponge meristem between blank group and model group were unobvious, but the expression of Cx43 in penis smooth muscle was declined significantly in the model group. Comparing with the model group, the expression of Cx43 in penis smooth muscle was increased in southing liver and nourishing blood group had statistical significance (P<0.05). Conclusions The dispersing liver and nourishing blood treatment based on the guidance of “Gancang” theory could effectively recovery the erectile functions through the mechanisms of affecting the expression of Cx43 in penis smooth muscle.

“Gancang” theory; Erectile dysfunction; Dispersing liver and nourishing blood; Cx43

四川省教育廳課題(No.12ZA033)

1.河南省鄭州人民醫院泌尿外科(鄭州 450003)；2.成都中醫藥大學第一附屬醫院男科(成都 610072)；3.四川省中西醫結合醫院男科(成都 610041)；4.河南中醫藥大學第一附屬醫院男科(鄭州 450008)；5.成都中醫藥大學第二附屬醫院男科(成都 610041)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.21.023

1003-8914(2016)-21-3115-04

?楠

2016-08-12)