釀酒酵母中SSK2基因與其他鎘耐受相關基因之間的雙基因缺失菌株構建

熊 兵， 楊 益， 蔣伶活

(江南大學生物工程學院 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

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釀酒酵母中SSK2基因與其他鎘耐受相關基因之間的雙基因缺失菌株構建

熊 兵， 楊 益， 蔣伶活*

(江南大學生物工程學院 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

鎘是一種嚴重的環境污染物，對人體具有致癌性，能蓄積在生物體內影響機體的生長、發育和生殖。有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)在調節細胞存活、增殖和分化中是重要的信號分子，并能夠被鎘脅迫激活。釀酒酵母中2個MAPK信號傳導途徑，高滲透壓甘油(High Osmolarity Glycerol，HOG)途徑和細胞壁完整性(Cell Wall Integrity，CWI)途徑都參與Cd2+脅迫下的細胞應答。為了進一步研究這兩條途徑在調控Cd2+脅迫方面的相互作用，以HOG途徑的蛋白激酶SSK2基因為例，通過合成遺傳陣列(Synthetic Genetic Array，SGA)方法，成功構建了SSK2基因與其他52個Cd2+耐受相關基因之間的雙基因缺失菌株。為大規模研究Cd2+耐受基因之間在調控鎘脅迫方面的遺傳學相互作用奠定了基礎，也為釀酒酵母的相關研究提供了一個新的遺傳學手段。

釀酒酵母；高滲透壓甘油(HOG)途徑；細胞壁完整性(CWI)途徑；合成遺傳陣列(SGA)；SSK2

鎘是一種嚴重的環境污染物，被國際癌癥研究機構定義為I類人體致癌物[1]，可以通過飲食和吸煙攝入人體，危害人類健康[2]。鎘與各種癌癥和心血管疾病的發生有關[3-4]，最近的研究表明鎘可能是導致茨海默疾病和帕金森綜合癥等神經性疾病的一個致病因素[5-6]。MAPK信號轉導途徑在真核生物中廣泛存在。MAPK是真核生物應答外界刺激的重要途徑之一。當生物感知外界刺激后，體內特異的MAPK途徑被激活，從而調整細胞作出反應。有研究表明Cd2+激活哺乳動物細胞c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路，促進活性氧族物質(reactive oxygen species，ROS)形成，介導細胞凋亡[7-8]。在雞肝癌細胞和白血病細胞中，Cd2+可以誘導p38 和胞外調節蛋白激酶(Extracellular Regulated protein Kinases，ERK1/2)的磷酸化[9-10]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞中存在5個MAPK級聯系統，由5種MAPK蛋白激酶(Hog1、Slt2、Smk1、Fus3和Kss1)分別控制HOG途徑和CWI途徑、孢子分化、菌絲形成和侵入生長以及細胞接合過程。前期研究發現，在釀酒酵母細胞中HOG途徑7個組分、CWI途徑6個組分的基因缺失株對鎘敏感[11]，說明HOG途徑和CWI途徑參與了鎘脅迫下的細胞應答。合成遺傳陣列SGA是由Charles Boone等發明的一種系統性構建雙基因突變株的方法，并能夠進行合成遺傳互作的整體性分析[12]，主要用于識別功能性基因，鑒定能夠相互作用或影響相同途徑的基因。它以細胞的生長表型作為基礎，采用圖像處理技術，定量分析基因之間正向和負向相互作用，生成復雜的遺傳網絡。本研究利用SGA方法一次性成功構建了HOG途徑SSK2基因與其他52個Cd2+耐受相關基因之間的雙基因缺失菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用到的釀酒酵母菌株有野生型Y2454(MATαmfa1::MFA1pr-HIS3；can1；ura3；leu2；his3；lys2)[13],以及單倍體BY4741(MATαhis3；leu2；met15；ura3)為背景的對Cd2+敏感的89個單基因缺失株[11](表1)。

1.1.2 引物 實驗所用引物見表1。

表1 酵母89個基因的編號及實驗所用引物

續表1

續表1

1.1.2 培養基 ① YPD培養基；② SD-His-Arg培養基(質量分數，%)：酵母氮源0.67，葡萄糖2，滅菌后加入過濾滅菌過的10×必需氨基酸混合母液(不含組氨酸和精氨酸)；③ 產孢固體培養基(質量分數，%)：瓊脂2，醋酸鉀1，酵母提取物0.1，葡萄糖0.05，添加組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶。

1.1.3 主要試劑 酵母轉化用ssDNA、LiAc和PEG 3350等試劑購自Sigma公司；SGA實驗所用藥物NAT、G418和L-Canavanine分別購自Werner BioAgents、上海生工和Sigma公司；TaqDNA聚合酶、限制性內切酶等試劑購自北京全式金公司。

1.1.4 主要儀器及設備 PCR反應儀(德國艾本德公司)、全溫搖瓶柜(太倉強樂實驗設備廠)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、凝膠成像系統(Bio-Rad)、全套384針孔影印板(美國Invitrogen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞的轉化 挑取活化的酵母單菌落接種于3 mL YPD 液體培養基中，30 ℃過夜培養至飽和。取500 μL過夜培養物接種到4.5 mL 2×YPD中，30 ℃培養3～4 h到對數期。12 000 r/min 瞬時離心10 s收集菌體，用無菌水洗1次，再用100 μL 0.1 mol/L LiAc溶液洗2次。向細胞沉淀中依次加入240 μL質量分數 50%PEG，36 μL 1 mol/L LiAc，10 μL 10 mg/mL ssDNA，目的DNA(5～10 μg)，1 mL吸頭上下吸3～4次，渦旋充分混勻，置于30 ℃孵育30 min，42 ℃水浴熱激30 min。室溫3 000 r/min離心1 min收集菌體，用1 mL無菌水水洗菌體，涂布到選擇性固體平板上，30 ℃培養3 d，獲得酵母轉化子。

2 結果與分析

2.1 靶菌株ssk2::natMX4的構建

在前期研究中，通過基因缺失株文庫的篩選，確定了89個基因缺失后對Cd2+敏感，其中包括7個HOG信號途徑的組份和6個CWI信號途徑的組分[11]。為了研究HOG和CWI兩個途徑之間，以及它們和其他Cd2+耐受性相關基因之間，在調控Cd2+脅迫方面的遺傳相互作用，需要構建HOG和CWI信號途徑組分基因之間以及它們和其他基因之間的雙基因缺失突變株。為了建立這個大規模構建雙基因缺失突變株的方法，這里僅以SSK2基因為例，擬構建SSK2與其他88個與Cd2+耐受有關的基因之間的雙基因缺失株。本研究利用SGA方法[14-15]的原理進行構建。首先獲得Y2454背景下的ssk2::natMX4單基因缺失株作為靶菌株，其基因型驗證如圖1B。

圖1 Y2454背景里的靶菌株ssk2::natMX4構建Fig.1 Generation of the ssk2::natMX4 mutant in Y2454 background

A: PCR擴增BY4741背景里ssk2::kanMX4敲除盒(第1泳道)；CK:BY4741菌株里野生型SSK2基因片段的PCR;B: Y2454背景里ssk2::natMX4基因型驗證(第1泳道)；CK:Y2454菌株里缺失基因ssk2::kanMX4片段的PCR

A: PCR amplification of thessk2::kanMX4 cassette from the BY4741 background；CK:PCR amplification of theSSK2 gene from the BY4741 background；B: Genotype verification of thessk2::natMX4 allele in the Y2454 background; CK:PCR amplification of thessk2::kanMX4 allele in the Y2454 background

2.2 SGA缺失株陣列的獲得

為了提高菌株構建效率，將88個BY4741背景下的基因缺失株依次點接在影印板的a、b、c和d四個區域，每個區域的菌株及排列順序都相同(圖2)。

圖2 88個SGA缺失株陣列分布Fig.2 Distribution of 88 SGA gene deletion mutants arraya、b、c和d四個區域均有96個點接位置，影印板中裝有YPD+150 μg/mL G418固體培養基。30 ℃培養1 dEach of four districts of a, b, c and d has 96 spots for inoculation. The plate containing YPD+150 μg /mL G418 solid medium is cultured for one day at 30 ℃

2.3 SGA篩選雙基因缺失株

SGA原本是用來進行高通量合成致死型分析的，在這里被用來篩選雙基因缺失株(圖3)。靶菌株ssk2::natMX4是MATα型的，而帶有kanMX4標簽的SGA陣列菌株是MATa型的，它們在YPD培養基上進行雜交，產生MATα/a型的雙倍體菌株，同時帶有kanMX4和natMX4這2個遺傳標簽。雙倍體菌株在產孢培養基上生成四分孢子，孢子有MATa和MATα兩種交配型。MFA1pr-HIS3報告子只在MATa型的細胞中才能表達，所以在SD-HIS的培養基上就能夠篩選出MATa型的單倍體孢子。此外，CAN1基因編碼一種高親和性通透酶，刀豆氨酸和精氨酸都是通過這種通透酶進入細胞的。因為刀豆氨酸是精氨酸的類似物，對細胞具有毒害作用，所以在缺少精氨酸的SD +刀豆氨酸(L-Canavanine)的培養基中，含有CAN1基因的菌株是致死的，因為它們攝取了刀豆氨酸，刀豆氨酸會代替精氨酸合成蛋白質，由于結構的不同導致蛋白功能出現異常，致使細胞死亡。因此，利用SD-His-Arg+L-Canavanine培養基就能夠篩選出不含有親本的MATa型單倍體孢子。最后利用YPD+G418+NAT培養基篩選出MATa型中的ssk2::natMX4xxx::kanMX4雙基因缺失株(圖4)。

圖3 合成遺傳陣列(SGA)方法[16]Fig.3 Synthetic genetic array (SGA) mthod[16]黑色實圓，表示ssk2基因缺失；灰色實圓，表示x基因(1-88號)缺失；黑色空圓，表示野生型SSK2基因；灰色空圓，表示野生型X基因(1-88號)Fillied black circle, ssk2 mutation; Fillied gray circle, gene x mutation; Empty black circle, wild type SSK2; Empty gray circle, wild type gne X

圖4 YPD+NAT+G418培養基篩選雙基因缺失株Fig.4 Double-gene deletion mutant selection on the plate containing YPD+NAT+G418大的面包型菌落為潛在的MATa型雙基因缺失菌株，小的不規則菌落為背景菌的生長Big round colonies are potential MATa cells lacking two genes, while small irregular colonies are background cell growth

2.4 雙基因缺失菌株的基因型驗證

將圖4中獲得的潛在雙基因缺失菌株在YPD+100 μg/mL NAT+150 μg/mL G418培養基上進行純化，挑取單菌落，提取基因組作為模板，用兩對引物進行PCR驗證(圖5)。上排電泳圖是利用引物SSK2-F/SSK2-R檢測SSK2基因是否缺失，下排電泳圖是利用引物X-F/X-R(X表示1～88號基因中的任何1個)檢測另一個基因是否缺失。對照都是待測基因的ORF框擴增。例如，從52、55、59、61、63、65、69和70號菌株的基因組中，除了能夠擴增出ssk2::natMX4DNA片段外(圖5的上排)，還能分別擴增出52、55、59、61、63、65、69和70號基因對應的kanMX4片段(圖5的下排)，說明它們是正確的雙基因缺失株。但是，從56和67號菌株擴增出2個DNA片段(圖5的下排)，表明這2個菌株是不正確的。此外，雖然能從60和66號菌株擴增出ssk2::natMX4DNA片段(圖5的上排)，但是它們自己的基因沒有被缺失，因為PCR擴增出來它們自己的ORF片段(圖5的下排)，所以也是錯誤的。

同理，最終獲得SSK2和其他共52個基因的正確雙基因缺失菌株(圖5未顯示；表2)，篩選效率達到59%。此外，剩下的41%基因可以通過另外1～2次類似的SGA篩選獲得。以上結果說明成功建立了SGA大規模遺傳篩選雙基因缺失株的方法，為研究HOG和CWI途徑在調控Cd2+敏感性方面的相互作用奠定了基礎，也為國內同行開展類似的酵母遺傳學研究提供了一種新的手段。

圖5 雙基因缺失株基因型驗證Fig.5 Genotype verification of double-gene deletion mutantsA：利用電泳圖上方的引物PCR驗證雙基因缺失株中的ssk2::natMX4;B：利用黑色短線下方的引物PCR驗證雙基因缺失株中被kanMX4替換的基因;W表示野生型BY4741菌株;M表示DNA markerA：PCR confirmation of ssk2::natMX4 in double-gene mutants. Primers are indicated above the gel；B：PCR confirmation of kanMX4 alleles in their correspoinding double-gene mutants of genes indicated below the gel (see Table 1 for their gene names). Primers are indicated below black bars；W：is the wild type BY4741 strain；M：DNA size marker

編號菌株名稱編號菌株名稱編號菌株名稱編號菌株名稱2ssk2vps822ssk2slt245ssk2gup173ssk2fab13ssk2csf124ssk2ste5046ssk2vps174ssk2pbs25ssk2vps1325ssk2swi650ssk2rlf275ssk2ypr064w7ssk2hog128ssk2vam351ssk2vps976ssk2tps18ssk2srn229ssk2mnn1152ssk2rox178ssk2ydl023c9ssk2fig431ssk2mid255ssk2bck181ssk2rpl37b10ssk2mid132ssk2vps3859ssk2hom683ssk2vps72

續表2

3 討 論

本研究通過合成遺傳陣列(SGA)手段構建了HOG途徑的蛋白激酶SSK2基因與其他52個Cd2+耐受相關基因之間的雙基因缺失菌株，為進一步研究HOG途徑和CWI途徑在鎘脅迫應答中的相互作用，以及細胞內參與鎘脅迫應答的基因的功能和相互關系提供了一種新的方法。同時這一結果對研究Cd2+耐受基因之間在調控鎘脅迫方面的遺傳學相互作用具有一定科學意義，為深入研究釀酒酵母細胞的Cd2+毒理作用提供了素材。

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Construction of Double-Gene Deletion Mutants between SSK2 & other Cadmium-Tolerant Genes in Wine-making Yeast

XIONG Bing, YANG Yi, JIANG Ling-huo

(Coll.ofBio-Engin.,JiangnanUni.,StateEngin.Lab.ofGrainFerment’nTechnol. &Tech.,Wuxi,Jiangsu214122)

Cadmium is a serious environmental pollutant, it has carcinogenicity to human body, and it could accumulate in bions affecting their growth, development and reproduction. Mitogen-activate protein (MAP) kinases are important signaling molecules regulating cell survival, proliferation and differentiation, and they can be activated by cadmium stress. Two MAP kinase signaling pathways, the cell wall integrity (CWI) pathway and high-osmolarity and glycerol (HOG) pathway, are involved in the response to cadmium stress inSaccharomycescerevisiae. In order to study their genetic interactions in regulating cadmium stress,SSK2 was used as an example and constructed its double-gene deletion mutants with other 52 cadmium-tolerant genes in the study, using the synthetic genetic array (SGA) method. The study provides a basis for understanding the genetic interaction between cadmium-tolerant genes and a new genetic means for related studies in wine-making yeast.

Saccharomycescerevisiae; HOG; CWI; SGA;SSK2

國家自然科學基金項目 (81371784) ; 江南大學自主研究計劃重點項目(JUSRP51313B)

熊兵 男，碩士研究生。研究方向為酵母遺傳學與分子生物學。E-mail: 460917014@qq.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導師。研究方向為酵母和絲狀真菌遺傳學與分子生物學。E-mail: linghuojiang@jiangnan.edu.cn

2015-04-09；

2015-04-30

Q939.97

A

1005-7021(2016)01-0049-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.009