Bcl-2抑制劑對黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的影響

董雅潔，高維娟，錢 濤，盧鍇鋒，朱炎杰，謝亞芹

(1.承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫學院，石家莊 050200；3.河北省人民醫院，石家莊 050051)

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研究報告

Bcl-2抑制劑對黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的影響

董雅潔1，高維娟2，錢 濤3，盧鍇鋒1，朱炎杰1，謝亞芹1

(1.承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫學院，石家莊 050200；3.河北省人民醫院，石家莊 050051)

目的探討黃芪注射液(AI)對Bcl-2抑制劑(TW-37)作用下的缺氧缺糖/復氧復糖(H/R)大鼠海馬神經元凋亡的影響。方法取原代培養8 d的胎鼠海馬神經元，隨機分為6組：正常對照組、H/R組、AI組、AI溶劑對照組、Bcl-2抑制劑(TW-37)+ H/R組、TW-37+AI+H/R組。除正常對照組外，各組均進行缺氧缺糖0.5 h，再于復氧復糖后七個時間點(0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h)分別進行指標檢測。采用MTT法檢測細胞活性，western blot法和RT-PCR法檢測海馬神經元Caspase-3蛋白和mRNA的表達。結果與正常對照組比，除0 h外，H/R組海馬神經元活性明顯降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白及Caspase-3 mRNA表達均明顯增強(P<0.05)；與H/R組相比，除0h外，AI組海馬神經元活性明顯增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；而AI溶劑對照組、TW-37+ H/R組及TW-37+AI+H/R組則無顯著差異(P>0.05)。結論黃芪注射液可通過激活Bcl-2抗凋亡機制增強H/R大鼠海馬神經細胞活性、降低Caspase-3表達，Bcl-2是黃芪注射液抑制H/R大鼠海馬神經元凋亡的重要靶點之一。

黃芪注射液；Bcl-2抑制劑；缺氧缺糖/復氧復糖；海馬神經元；細胞凋亡；Caspase-3

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是臨床缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)常見的病理生理過程，程序性細胞凋亡是神經元發生損害的重要機制。Bcl-2基因家族是線粒體信號轉導通路中重要的調控基因之一，其中抗凋亡相關基因Bcl-2與CIRI的發生密切相關[1-2]。本課題組前期的實驗研究證實，“補藥之長”黃芪的精純制劑黃芪注射液(astragalus injection, AI)可抑制原代培養的缺氧缺糖/復氧復糖(hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation，H/R)大鼠胎鼠的海馬神經元凋亡[3-4]，并初步推斷其抗凋亡作用與上調Bcl-2的表達有關[5]。因此本實驗選擇特異性Bcl-2抑制劑TW-37，觀察黃芪注射液對Bcl-2抑制劑預處理后的缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元Caspase-3表達改變，明確其發揮腦保護作用的具體靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級新生24～48 h SD乳大鼠，體重8～10 g，雌雄不限，購于河北省實驗動物中心【SCXK(冀)2013-1003】。動物實驗于承德醫學院屏障環境動物室進行【 SYXK(冀)2013-0026】。

1.1.2 主要試劑 NSE抗體(AB53025)，英國Abcam公司；GFAP抗體(BA0056)，武漢Boster公司；Caspase-3抗體(SC56050)，美國santa cruz公司；Bcl-2抑制劑(TW-37)，美國Selleck公司；免疫組化檢測試劑盒(SP9001)，北京ZSGB-BIO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)，上海Beyotime公司；Caspase-3引物F：5′-ACTGGACTGTGGCAT TGAG-3′、R:5′-GAAACAATACATGGAATCTG-3′和β-actin引物F：5′-CAT CCTGCGTCTGGACCT-3′、R： 5′-TCAGGAGGAGCAATGATC TTG-3′，均由上海Sangon Biotech公司合成；RT-PCR試劑盒(RR001Q)，大連Takara Bio公司；黃芪注射液(批號Z51021776)，成都地奧九泓制藥廠。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱(HERAcell 150i)，德國Heraeus公司；全自動酶標儀(Multiskan MK-3)，芬蘭Thermo Fisher公司；穩壓穩流電泳儀(DYY-6C)，北京LIUYI公司；RT-PCR儀(PTC-100)，美國MJ Research公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元的分離與培養 無菌條件下，取24 h新生SD大鼠，浸于冰浴的75%乙醇1 min消毒，用顯微眼科鑷鈍性分離并夾取海馬組織，放入冰浴的盛有D-Hanks液的培養皿中，剔除含有血管的軟腦膜，用體積分數為0.125%的胰酶的同時充分消化，15 min后添加馬血清終止消化。根據海馬組織量加入適量有血清種植培養液，充分吹打，制成細胞懸液，用200目濾網過濾。經胎盤藍計數后，接種在經多聚賴氨酸包被的培養皿或培養瓶中，放入37℃恒溫、5%CO2，飽和濕度培養箱中常規培養。8 d后用H/R法建立腦缺血再灌注損傷模型。

1.2.2 免疫化學染色法檢測海馬神經元純度 取經冷丙酮固定的海馬神經元，采用免疫組化SP法檢測神經元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質纖維酸性蛋白A(GFAP)表達，具體操作按照ZSGB-BIO免疫組化檢測試劑盒說明書進行。分別加入一抗NSE多克隆抗體(1∶50稀釋)，GFAP多克隆抗體(1∶100稀釋)。對免疫組化陽性結果采用MiVnt圖像分析系統進行半定量分析。陽性細胞計算方法：高倍鏡下計算3個非連續視野陽性數。

1.2.3 實驗分組及體外H/R模型的建立 將體外培養8 d的大鼠胎鼠海馬神經元隨機分為6組：正常對照組、H/R組、AI組、AI溶劑對照組、TW-37組、TW-37+AI組。除正常對照組外，其余各組用預熱的無糖Earle’s液替代原培養基，并將其置于37℃、高純氮氣溫箱中培養0.5 h，隨后用正常無血清培養液，在飽和濕度培養箱(37℃、5%CO2)中常規培養[6]。AI組于缺氧缺糖前10 min加入AI(終濃度為0.5 g/L)；AI溶劑對照組換為等量無菌去離子水(pH7.4)；TW-37組加入TW-37(終濃度為400 nmol/L)；TW-37+AI組缺氧缺糖前15 min加入TW-37，5 min后再加入等量AI，直至細胞培養結束。各組均于復氧復糖七個不同時間點(0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h)分別進行海馬神經元活性、Caspase-3蛋白及其mRNA的表達的測定。

1.2.4 MTT法檢測海馬神經元活性 用有血清培養基稀釋后配成細胞懸液，以5×104個/mL的密度接種于96孔板，各組均于復氧復糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h、120 h后，在各孔中加入10%孔內培養液量的濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃恒溫孵育4 h，棄去全部培養液，每孔加200 μL DMSO使結晶迅速溶解，放入酶標儀中震蕩10 min，在492 nm處測定OD值。

1.2.4 Western blot法檢測海馬神經元Caspase-3蛋白的表達 收集裂解的神經細胞的胞質蛋白，具體操作步驟按試劑盒和儀器的說明書執行，并采用BCA法進行定量。蛋白上樣量為30 μg，SDS-PAGE分離膠體積分數12%，PVDF膜轉膜，浸入5%Milk-TBST封閉液中封閉2 h，加入兔抗Caspase-3單克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃振搖過夜后，用TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000稀釋)，室溫孵育1 h。洗膜后，用化學發光法顯影、定影。膠片掃描后，將顯影條帶輸入Quantity One 凝膠分析系統，進行定量分析。

2 結果

2.1 海馬神經元純度

NSE細胞免疫化學結果顯示：體外無血清原代培養8 d的海馬神經細胞，胞體飽滿，成錐體狀，邊緣有光暈，突起較多，末端彼此相互連接形成復雜的神經網絡。光鏡下觀察發現，NSE表達陽性細胞為棕黃色，高倍鏡下隨機選擇三個視野中統計陽性神經細胞的比率，計算海馬神經細胞純度為 (94.69±0.93) %，GFAP染色則為陰性，證明原代培養的海馬神經細胞中膠質細胞較少(圖1)。

注：A：神經元特異性烯醇化酶；B：GFAP膠質纖維酸性蛋白A。

2.2 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經細胞活性的影響

MTT結果顯示：與正常對照組相比，除0 h外，H/R組海馬神經元活性均顯著降低(P<0.05)；而與H/R組細胞相比，除0 h外，AI組海馬神經元活性明顯升高(P<0.05)，而AI溶劑對照組、TW-37組及TW-37+AI組與之相比則無顯著差異(P>0.05)(表1，圖2)。

表1 MTT法檢測Bcl-2抑制劑及黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元活性的影響>Tab.1 The effects of Bcl-2 inhibitor and astragalus injection on the activity in the rat hippocampal neurons after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation detected by MTT

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復氧復糖組比，*P<0.05。

2.3 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經元Caspase-3蛋白表達的影響

Western blot結果顯示：與正常對照組相比，除0 h外，其余各時間點H/R組海馬神經元Caspase-3蛋白的表達均顯著增高(P<0.05)，復氧復糖后24 h最高；與H/R組比，除0 h外，在其余各時間點AI組海馬神經元Caspase-3蛋白的表達均顯著降低(P<0.05)，而AI溶劑組、TW-37組及TW-37+AI組海馬神經元Caspase-3蛋白的表達在各點與之相一致，無顯著差異 (P>0.05)(圖3)。

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復氧復糖組比，* P<0.05。

2.4 黃芪注射液及Bcl-2抑制劑對H/R大鼠海馬神經元Caspase-3的mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示：與正常對照組比，除0 h外，其余各時間點H/R組海馬神經元Caspase-3 mRNA的表達均顯著增加(P<0.05)，24h最高；與H/R組比，除0 h外，在其余各時間點AI組Caspase-3的mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，而AI溶劑組、TW-37組及TW-37+AI組的海馬神經元Caspase-3的mRNA的表達在各點與之無明顯差別(P>0.05)(圖4)。

注：與正常對照組比，△P <0.05；與缺氧缺糖/復氧復糖組比，* P<0.05。

3 討論

缺血后再灌注過程中引起的神經元的損傷是造成ICVD的發病率、致死率逐年上升的重要病理生理機制，而H/R是缺血再灌注損傷的一種最常見的表現形式[7-8]。我們前期的研究表明，H/R可通過激活JNK信號轉導通路，上調C-JUN氨基末端激酶-3(JNK3)的表達，并引發其下游底物Caspase-3表達增加，進而誘發神經元凋亡[4,9]。

Bcl-2基因家族是JNK信號轉導通路中重要的調控因素，作為代表的Bcl-2和Bax二者在功能上相互對立[10]。定位于線粒體外膜上的Bcl-2含有抗凋亡蛋白所特有的結構域BH4，決定其抗細胞凋亡功能的存在[11]；定位于胞漿中的 Bax的結構中含有BH1、BH2和BH3三個結構域，可促進細胞的凋亡，兩蛋白間的比例決定是否發生細胞凋亡[12]。研究發現，當凋亡信號刺激后Bax可轉位至線粒體膜上，Bax/Bax同源二聚體形成增多，Bcl-2抑制作用減弱，利于形成通透性PT孔道，釋放出細胞色素C等促凋亡因子，即刻與凋亡酶激活因子Apaf-1及dATP結合，形成復合體，從而啟動下游的caspase級聯反應，激活關鍵效應蛋白酶Caspase-3，進入凋亡進程[13-15]。

抑制細胞凋亡是治療缺血性腦損傷的有效途徑之一，中藥制劑對CIRI神經元凋亡干預作用的研究是目前研究的熱點。黃芪注射液是從黃芪中提取的有效成分精制而成，包括多種皂苷、多糖、氨基酸和微量元素等，每毫升注射液中所含有效成分相當于含生藥2 g。大量研究發現，其在擴血管、清除氧自由基，增加微循環灌注、增強免疫功能以及抗血栓等方面具有一定的藥理活性，可抑制神經元凋亡的發生，臨床應用廣泛[16-17]。

本實驗選取對缺血缺氧最為敏感的胎大鼠海馬神經元進行體外原代培養，用H/R法模擬CIRI，并用黃芪注射液和Bcl-2抑制劑干預海馬神經元缺氧缺糖/復氧復糖模型。實驗結果顯示：海馬神經元經缺氧缺糖/復氧復糖后，各個時間點的OD值明顯減低，細胞活性明顯下降，Caspase-3蛋白及mRNA的表達均明顯增加(P<0.05)，24 h最高。這證明海馬神經元在H/R條件下凋亡信號觸發啟動，Caspase-3表達升高，進一步地誘導細胞凋亡，在24h Caspase-3的表達達到最高，分析原因可能是先通過下調Bcl-2的表達，封閉Bax形成孔道的活性減弱，進而活化Caspase-3，促使細胞凋亡[18-20]。在以后各時間點Caspase-3表達量平穩下降，推測可能是與磷酸化的Caspase-3半衰期密切相關[21]。而與同時間點H/R組相比，AI組海馬神經元活性顯著升高(P<0.05)，而Caspase-3蛋白和mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，AI溶劑對照組、TW-37組及TW-37+AI組與之相比卻無顯著差異(P>0.05)，則提示Bcl-2抑制劑可拮抗黃芪注射液提高H/R大鼠海馬神經細胞活性、降低Caspase-3表達的作用，黃芪注射液是以Bcl-2為靶點來抑制Caspase-3表達，抑制細胞凋亡。且因為黃芪注射液可使海馬神經元Caspase-3蛋白表達降低，Caspase-3 mRNA的表達也相應的下調，說明黃芪注射液是在轉錄水平抑制Caspase-3的表達。因此，推測黃芪注射液是以Bcl-2為靶點來抑制Caspase-3表達，抑制細胞凋亡，這為缺血性腦血管病的靶向治療提供了理論依據。

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The influence of Bcl-2 inhibitor on the alleviation action of astragalus injection on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation

DONG Ya-jie1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao3, LU Kai-feng1,ZHU Yan-jie1, XIE Ya-qin1

(1.Department of Pathophysiology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China;2.Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China;3.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

Objective To observe the influence of Bcl-2 inhibitor (TW-37) on the alleviation action of astragalus injection (AI) on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation (H/R). Methods The hippocampal neurons were isolated from fetal rat and cultured for eight days. The cells were randomly divided into six groups: normal control group, H/R group, AI group, AI solution group (sterile deionized water), TW-37 group, TW-37 with AI group. All groups were tested after 0 h, 0.5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 72 h and 120 h since they were treated with hypoglycemia and reoxygenation after deprived of oxygen and glucose for 30 min except normal control group. The activity of hippocampal neurons were detected with MTT，The expression level of Caspase-3 was measured by western blotting, the expression of mRNA of Caspase-3 was tested by RT-PCR. Results Compared with normal control group, aside from 0 h group, the activity of neurons decreased obviously (P<0.05), moreover, the protein and mRNA expressions of Caspase-3 were enhanced significantly (P<0.05) in H/R groups. Compared with H/R group, the activity of neurons increased obviously in astragalus group (P<0.05), and the expressions of Caspase-3 protein and the expression of Caspase-3 mRNA in the AI groups decreased significantly (P<0.05) besides 0 h group; but there was no significant difference in both AI solution group、TW-37+ H/R and TW-37+AI+H/R group (P>0.05). Conclusions Astragalus injection to increase the neurons activity and decrease the expression level of Caspase-3 in hippocampal neurons of rat by activating the effect of anti-apoptosis of Bcl-2. Bcl-2 is one of the targets exerting the inhibitory action of astragalus injection on apoptosis of hippocamal neurons of rats induced by hypoxia /hypoglycemia and reoxygenation.

Astragalus injection; Bcl-2 inhibitor; Hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation; Hippocamal neurons of rats; Apoptosis; Caspase-3

河北省科技支撐計劃項目(13272504D)；河北省普通高等學校高層次人才科學研究計劃項目(GCC2014031)；河北省教育廳青年基金項目(Q2012002)；承德醫學院自然科學研究計劃項目(Q201506)；河北省高校重點學科建設項目資助(冀教高【2013】4號病理學與病理生理學)。

董雅潔(1980-)，女，碩士生，研究方向：腦血管病發病機制及中醫藥防治。Email： dyj9606@163.com。

高維娟(1966-)，女，教授，研究方向：腦血管病發病機制及中醫藥防治。Email： gwj6088@163.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0011-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.003

2016-06-28