玉米淀粉和黃漿發酵羅耳阿太菌雙響應值優化

張桂弘 李鴻梅 魏 明 閔偉紅

(吉林農業大學食品科學與工程學院，長春 130118)

玉米淀粉和黃漿發酵羅耳阿太菌雙響應值優化

張桂弘 李鴻梅 魏 明 閔偉紅

(吉林農業大學食品科學與工程學院，長春 130118)

為獲得羅耳阿太菌β-1，3葡聚糖酶和胞外多糖同時高產的發酵條件，以玉米淀粉和玉米黃漿作為發酵培養基的重要組分，以羅耳阿太菌β-1,3葡聚糖酶產量和胞外多糖產量為指標，選擇培養溫度、培養時間、搖床轉速為優化因素，在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗進行雙響應值優化，對所得結果的三維圖和等高線疊加圖進行分析，獲得了雙指標同時達到最優的發酵條件。結果表明：接種量5%、培養溫度28.5 ℃、培養時間7.5 d、搖床轉速180 r/min時，粗酶產量39.96 U/mL，多糖產量18.11 g/L，分別達到了預測值的98.96%和99.27%。

玉米淀粉 玉米黃漿 羅耳阿太菌多糖 β-1,3葡聚糖酶 雙響應值 發酵條件優化

吉林省是我國玉米生產大省，玉米深加工技術在延長產業鏈、優化產業結構、增加產品附加值方面發揮著重要作用，是解決三農問題的一個重要措施。玉米淀粉的生產是玉米深加工的一個重要方面，其生產過程中所產生的玉米黃漿也含有多種可溶性蛋白、生長素和一些前體物質。本課題組篩得一株能夠在以玉米淀粉、玉米黃漿為碳、氮源的培養基上繁殖并產β-1,3葡聚糖酶和多糖的羅耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)[1]。

羅耳阿太菌多糖(Atheliarolfsiiexopolysaccharides)是由羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)發酵產生的一種胞外多糖[2]，多糖的主鏈由D-吡喃葡萄糖以β-1,3糖苷鍵連接而成，因其具有免疫調節[3]、降低膽固醇[4]、降血糖[5]等生理活性，受到了科研工作者的廣泛關注。β-1,3葡聚糖酶廣泛存在于動物、植物、微生物中，能夠特異性地作用于以β-1,3糖苷鍵連接的多糖聚合體[6]，這一特性賦予該酶水解真菌細胞壁的能力[7]，使它不但在啤酒生產、果酒釀造以及食品保鮮等行業中具有重要應用[8-9]，而且在糧食作物病蟲害防治領域發揮重要作用[10]。

本課題組在以玉米淀粉和玉米黃漿培養羅耳阿太菌發酵產多糖的過程中發現該菌株同時分泌β-1,3葡聚糖酶，因此本試驗試圖實現一次發酵獲得2種產品雙贏，不僅節約能源，更可提高淀粉產品的附加值，以期在玉米加工工業發揮作用，深化且優化糧食產業深加工技術。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和設備

1.1.1 原料

羅耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)由吉林農業大學發酵工程實驗室分離純化并石蠟封存。

玉米淀粉：市售；玉米黃漿：黃龍食品有限公司，pH 4.16，蛋白含量4.2 g/L。

1.1.2 試驗試劑

PDA培養基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 15～20，自然pH。羅耳阿太菌發酵培養基(g/L)：玉米黃漿 5%(V/V)，玉米淀粉 30，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，NaNO33.0，檸檬酸 0.5，pH為4.5。SDS-PAGE試劑盒。Tris-Gly電極緩沖液(g/L)：Tris 14.4，甘氨酸3(變性另加SDS 1)。考馬斯亮藍染色液：50%(V/V)甲醇，0.2%(m/V)考馬斯亮藍R-250，10%(V/V)乙酸，40%(V/V)H2O。考馬斯亮藍脫色液：20%(V/V)甲醇，20%(V/V)乙酸，60%(V/V)H2O。孵育液：100 mL醋酸鉀(50 mmol/L，pH 5.5)溶液中含 0.1 g昆布多糖。顯色液：200 mL NaOH(1.0 mol/L)中含0.3 g 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)。DNS：稱取6.5 g 3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中，移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL 2 mol/L NaOH溶液，再加入45 g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL。海帶多糖、羅耳阿太菌多糖及透析袋(截留相對分子質量為6 000～8 000)：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器設備

Z36HK赫莫氏低溫冷凍高速離心機：德國Hermle公司；DCY-0506低溫恒溫槽：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FD-1B-50凍干機：北京博醫康儀器有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀：美國Perkin Elmer公司；V-GES垂直電泳槽、ELITE 300 Plus電泳儀：美國Wealtec公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

取最優條件下發酵的發酵液，加入1/3體積pH 5.0 50 mmol/L Tris-HCl，30 ℃振蕩20 min，4 ℃ 8 000 r/min離心30 min，上清液調節pH為3.5，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min。離心后上清液加1.7倍體積無水乙醇5 ℃醇沉17 h[11]， 取沉淀4 ℃透析過夜，袋內物凍干稱重，傅里葉紅外光譜掃描；下層沉淀用高純水復溶，凝膠電泳。

1.2.2 酶及多糖的測定

酶活的測定：以海帶多糖為底物，30 ℃、pH 5.5的條件下用DNS法測定還原糖的變化以確定酶活[12]。葡萄糖標準曲線為：y=0.462 7x-0.001 9(R2=0.999 6；y為吸光度；x為還原糖含量/mg/mL。

多糖產量(g/L)：單位體積發酵液中粗多糖質量。

1.2.3 羅耳阿太菌發酵培養的單因素試驗

單因素試驗在250 mL三角瓶中進行，接種量5%，選擇培養溫度、培養時間、搖床轉速、裝液量作為考察的4個因素。培養溫度設定為20、25、30、35、40 ℃，培養時間設定為5、6、7、8、9 d，搖床轉速設定為125、150、175、200、225 r/min，裝液量設定為80、90、100、110、120 mL。每個水平重復3次，取其平均值進行計算分析。試驗過程中的不變水平為：培養溫度30 ℃、搖床轉速175 r/min、裝液量100 mL、培養7 d提取多糖，培養8 d提取酶。

1.2.4 響應面法雙指標優化發酵條件

根據單因素試驗結果設計響應面試驗，選取培養溫度、培養時間、搖床轉速為3個因素，以粗酶產量和多糖產量為響應值，按照表1進行試驗。

表1 響應面分析因素水平表

1.2.5 粗酶液的非變性凝膠電泳及活性染色

分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。電泳后，切取2個泳道的凝膠做常規考馬斯亮蘭 R-250 染色。切另外2個泳道的凝膠用重蒸水沖洗3次，放入 50 mmol/L的醋酸鉀中緩慢振蕩孵育5 min。再將凝膠移入75 mL 50 mmol/L醋酸鉀(含 0.1 g海帶多糖)溶液中30 ℃孵育30 min，用重蒸水沖洗3次，放入200 mL 1 mol/L的NaOH溶液(含 0.3 g TTC)中，加熱至出現紅色條帶為止。

SDS-PAGE采用相同配比的分離膠和濃縮膠。電泳后用考馬斯亮藍R-250染色，在40 ℃下染色過夜，在80 ℃下脫色1 h，得到條帶清晰的凝膠。對比活性染色和變性染色結果，得出目標酶的條帶位置。

1.2.6 多糖的結構預測

取羅耳阿太菌胞外多糖1 mg與5 mg KBr混合放入干燥的研缽中，在紅外燈照射下研磨至顆粒大小2.5 μm以下，將樣品粉末放入壓片模具中制得透明的樣品片。利用傅里葉紅外光譜進行結構分析，在3 500～600 cm-1條件下掃描獲得光譜圖。

2 結果與討論

2.1 發酵培養的單因素試驗結果

發酵培養羅耳阿太菌生產多糖和酶的單因素試驗結果如圖1所示。

由圖1a可知，隨著培養溫度的升高，多糖和酶產量都有所提高，當溫度達到30 ℃時，二者產量幾乎同時達到最大值。隨著溫度繼續上升，二者產量反而下降，這可能是由于溫度過高不利于羅耳阿太菌的生長，影響了酶和多糖的合成。

由圖1b可知，在發酵7 d時，多糖的產量最高，繼續延長發酵時間，多糖產量下降，這可能是由于在發酵中后期，培養液中的碳源幾乎耗盡，由β-1,3葡聚糖酶作用的可逆反應開始向逆反應方向進行，酶催化多糖的水解致使多糖產量下降。也正是如此，這一作用開始促進微生物對酶的積累，在發酵進行的第8天，酶的產量達到一個高峰，但后期營養物質缺乏，菌體生長進入衰亡期，使代謝產物酶的產量急劇下降。

由圖1c可知，在搖床轉速為175 r/min時，多糖和酶產量均達到峰值。這是由于適當的振蕩會增加菌體與發酵液中營養物質的接觸面積，有助于菌株的生長，因此隨著搖床轉速的提高，2個指標都呈現上升的趨勢，當轉速高于175 r/min后，繼續提高轉速反而會導致指標產量下降，這可能是由于過高的轉速導致剪切力變大，從而影響多糖和酶穩定結構的形成，致使二者產量下降。

圖1 培養溫度、培養時間、搖床轉速、裝液量對粗酶和多糖產量的影響

由圖1d可知，裝液量不同時，2個指標的產量雖有輕微波動，但都趨于平穩，這可能是由于溶氧率對該菌種的生長無顯著影響，因此，不選擇裝液量作為響應面的分析因素。

2.2 響應面法雙指標優化最佳發酵工藝條件

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結果分析

根據單因素試驗結果，選擇培養溫度、培養時間、搖床轉速作為Box-Behnken中心組合試驗設計的3個因素開展試驗，雙指標優化最佳發酵條件的響應面試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

雙指標響應值所得回歸模型函數表達式：

粗酶產量=-305.22+7.96X1+27.01X2+1.45X3+0.24X1X2-7.10E-003X1X3-0.04X2X3-0.15X12-1.76X22-2.64E-003X32(R2=0.982 7)

多糖產量=-58.45+1.48X1+10.72X2+0.18X3-0.02X1X2+2.8E-004X1X3-1.4E-003X2X3-0.02X12-0.67X22-4.92E-004X32(R2=0.987 2)

以上2個方程的R2值都接近于1，說明通過二次回歸得到的多糖及粗酶產量的模型與試驗擬合較好，可靠性高。

2.2.2 響應面立體圖及方差分析

響應值Y1(粗酶產量)和Y2(多糖產量)擬合模型的方差分析見表3。從表3中可以判斷，培養溫度和培養時間對粗酶產量影響極顯著，培養溫度和培養時間交互作用極顯著，培養溫度和搖床轉速與培養時間和搖床轉速交互作用影響顯著，3個因素的平方均影響極顯著。從響應面立體圖(圖2)可知，3個因素交互作用的立體圖上都存在極值，培養溫度和培養時間的側剖面圖弧度比搖床轉速的側剖面弧度更大，說明培養溫度和培養時間對模型的影響比搖床轉速大；從投影的等高線圖觀察，培養溫度和培養時間的等高線圖更接近于橢圓，說明二者的交互作用更加顯著，因此，選擇培養溫度和培養時間交互作用的等高線圖展開接下來的分析更有意義。

表3 回歸方程的方差分析

注：**極顯著水平(P<0.01)，*顯著(P<0.05)。

由表3還可以看出，培養溫度、培養時間對多糖產量影響極顯著，3個因素的平方對模型的影響均為極顯著。從響應面立體圖(圖3)得知，3個圖像中都存在響應值的最大值，所選擇的試驗范圍屬于極值附近的小范圍，符合響應面適用條件，3個立體圖側剖面的弧度顯示培養溫度和培養時間的弧度較大，說明培養溫度和培養時間對模型的影響比搖床轉速顯著，立體圖的等高線圖顯示，培養溫度和培養時間交互時，等高線圖為橢圓形，說明二者的交互作用對模型影響大，其余2個交互作用的等高線圖趨近圓形，說明對模型的影響不大，因此，選擇培養溫度和培養時間交互作用的等高線圖繪制等高線疊加圖(圖4)。

2.2.3 雙指標最優發酵條件的確定及驗證

從模型的方差分析顯示，2個響應面都存在對模型影響較顯著的2個因素X1和X2，并且它們的交互作用也存在顯著或極顯著的影響，從圖2和圖3可以看出，每個響應面都存在響應值較高的因素范圍，將其疊加(圖4)，進一步縮小最優區域的范圍。通過SAS軟件優化程序[13]，確定出各響應值的X1、X2的最優范圍。Y1的培養溫度為26.4～29.7 ℃，培養時間為7.0～8.6 d，Y2的培養溫度為26.1～30.9 ℃，培養時間為7.2～8.1 d。將二者交互作用的等高線圖疊加，可以直觀地看出2個指標同時達到較高水平的區域，結合SAS分析結果和響應面的優化條件，可以確定出雙指標的最優發酵條件為：培養溫度27.92～28.86 ℃，培養時間7.38～7.53 d，搖床轉速178.17～183.29 r/min，此時羅耳阿太菌多糖產量的理論預測值為18.24 g/L，粗酶產量的理論預測值為40.38 U。依據最優工藝范圍，為方便操作，選擇培養溫度28.5 ℃，培養時間7.5 d，搖床轉速180 r/min進行驗證試驗，結果表明，此條件下粗多糖產量為18.11 g/L，粗酶產量為39.96 U/mL，分別達到了預測值的99.27%和98.96%。試驗值與預測值接近，誤差較小，說明二次多項式的擬合模型與等高線疊加所得到的優化區域符合試驗目標。

圖2 發酵條件交互作用對粗酶產量影響的立體分析圖

圖3 發酵條件交互作用對粗多糖產量影響的立體分析圖

圖4 羅耳阿太菌發酵培養條件優化的等高線疊加圖

目前，工藝優化大多采用均勻設計或正交試驗設計，通常為固定其他因素，單一考慮一個因素為變量的單因素考察法，無法考察多個因素之間的相互作用，更無法得到適用多個響應值的最優工藝條件。響應面分析法可以利用二次回歸方程，擬合多個試驗因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程分析，得到最佳工藝參數。本試驗即采用這一方法實現了多產物的共贏。

2.3 活性染色確定目的蛋白

同時對粗酶液進行非變性凝膠電泳的活性染色及SDS-PAGE的考馬斯亮藍R-250染色。所得結果如圖5所示，左側為考馬斯亮藍R-250染色的蛋白圖譜，右側為活性染色的對照圖，從圖5可以看出，活性染色圖譜上存在一條顏色較深的條帶，這表明粗酶液中存在具有β-1,3葡聚糖酶活性的蛋白將孵育液中的海帶多糖水解為還原糖。

圖5 考馬斯亮藍R-250染色與活性染色圖譜

β-1,3葡聚糖酶作為羅耳阿太菌胞外多糖合成的關鍵酶，影響著多糖的合成同時促進多糖的分解，該酶有可能決定著羅耳阿太菌多糖的產量、結構以及性質[14]，通過蛋白質組學以及基因工程學手段對該酶進行探究以提高羅耳阿太菌胞外多糖產量和活性是未來研究的方向，本試驗也將為這一方面的研究奠定基礎。

2.4 羅耳阿太菌胞外多糖的紅外光譜

羅耳阿太菌胞外多糖的紅外光譜圖見圖6。

圖6 多糖的紅外光譜圖

羅耳阿太菌胞外多糖在食品工業、石油工業以及制藥工業等方面都有重要應用，其免疫活性和抗病毒活性吸引了眾多科研工作者的研究興趣。尋找其結構中的功能位點，利用生物工程手段，生產出更多具有活性、有益人類的多糖是我們未來研究的目標。

依據Sutherland[16]提出的胞外多糖合成的一般途徑(Ⅰ底物的吸收；Ⅱ細胞內形成多糖；Ⅲ多糖從細胞排除)推測：葡萄糖首先在己糖激酶(HK)的作用下進入細胞，六磷酸葡萄糖在焦磷酸化酶(UGP)的作用下生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-G),與脂質作用生成脂質焦磷酸葡萄糖，鏈式聚合釋放焦磷酸脂后形成多糖，與此同時β-1,3葡聚糖酶合成并發揮作用，催化主鏈D-吡喃葡萄糖以β-1,3糖苷鍵連接形成羅耳阿太菌多糖。發酵后期其他碳源耗盡，激發β-1,3葡聚糖酶活性增強，促進多糖降解為葡萄糖小分子，為微生物提供ATP、形成還原型輔酶或為生物合成提供中間物質。目前，關于羅耳阿太菌β-1,3葡聚糖酶和胞外多糖在生物體中合成規律的研究依然鮮見。Rapp[17]探究羅耳阿太菌β-1,3葡聚糖酶活性過程中，僅指出發酵后期碳源耗盡時，生物體可利用自身分泌的胞外多糖提供碳源。因此，有關羅耳阿太菌胞外多糖和β-1,3葡聚糖酶更深入的代謝關系以及多糖合成與其他糖代謝酶的相關性還有待進一步研究。

3 結論

利用玉米淀粉和玉米黃漿為培養基，成功培養出產羅耳阿太菌胞外多糖和β-1,3葡聚糖酶的羅耳阿太菌，最優發酵條件為：培養溫度28.5 ℃，培養時間7.5 d，搖床轉速180 r/min，多糖產量18.11 g/L，粗酶產量9.96 U/mL。

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Optimization of Corn Starch and Corn Soak Solution FermentingAtheliarolfsiiby Double Response Values

Zhang Guihong Li Hongmei Wei Ming Min Weihong

(College of Food Science and Engineering Jilin Agricultural University, Changchun 130118)

This paper was to obtain the high yield of Athelia rolfsii β-1,3-glucanase and exopolysaccharides at the same time, using corn starch and corn soak solution as important components of culture medium,Atheliarolfsiiβ-1,3-glucanase and exopolysaccharides as indicators, fermentation temperature, fermentation time and stirrer speed as optimizing factors, the double response values of Athelia rolfsii β-1,3-glucanase and exopolysaccharides were optimized by response surface test based on single factor test. The results of response surface stereogram and overlay contour analysis showed that the optimal fermentation conditions were as follows: 5% inoculum size, 28.5 ℃, 7.5 d, 180 r/min. The primary enzyme production was 39.96 U/mL, theAtheliarolfsiiexopolysaccharides production was 18.11 g/L at the same time, reaching 98.96% of predicted primary enzyme production and 99.27% of predicted exopolysaccharides production.

corn starch, corn soak solution,Atheliarolfsiiexopolysaccharide, β-1,3-glucanase, double response values, optimal culture conditions

TQ920.6

A

1003-0174(2016)12-0118-07

吉林省科技發展計劃(20126037)

2015-04-10

張桂弘，女，1990年出生，碩士，發酵工程

李鴻梅，女，1971年出生，教授，制糖工程