液質聯用法檢測糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素

張家寧 丁 軻 郭思夢 韓 濤 陳湘寧

(北京農學院食品科學與工程學院；食品質量與安全北京實驗室；農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206)

液質聯用法檢測糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素

張家寧 丁 軻 郭思夢 韓 濤 陳湘寧

(北京農學院食品科學與工程學院；食品質量與安全北京實驗室；農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206)

建立糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的液相色譜—質譜聯用分析方法。樣品經乙腈/水溶液(84∶16，V/V)提取后用Mycosep?226多功能柱凈化，Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱分離，液相色譜—質譜聯用(LC-MS/MS)測定。結果表明，樣品中4種單端孢霉烯類真菌毒素在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數均不低于0.995，檢出限為2～5 μg/kg，3個加標水平下平均回收率為73.19%～107.39%，相對標準偏差為1.46%～13.24%。表明該方法凈化效果好、靈敏度高，適用于同時檢測單種糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的殘留量。

單端孢霉烯類真菌毒素 液相色譜—串聯質譜 糧谷制品

單端孢霉烯類真菌毒素是鐮刀菌毒素中一大族化學性質相關的真菌毒素，目前已知的有200多種[1]。單端孢霉烯類真菌毒素對人畜健康有很大的危害[2-6]，且其污染已成為糧食減產和質量下降的主要原因，對全球的糧食貿易具有重要影響[7]。據流行病學調查顯示，單端孢霉烯類真菌毒素廣泛存在于各種糧食作物(如小麥、玉米、大麥、燕麥等)和加工產品(如啤酒和面包等)，多見于潮濕環境中儲藏的發霉糧食中[2]。經常從受污染的糧食和飼料中被檢出的有4種：T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA，具有分布范圍廣、污染糧食及其制品的種類多等特點。

單端孢霉烯類真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)[8]，氣相色譜法(GC)[9]，氣質聯用法(GC-MS)[10]，高效液相色譜法(HPLC)[11]和液質聯用法(LC-MS或LC-MS/MS)[12-16]等。其中，液質聯用法以其快速、靈敏和檢測范圍大等優點廣泛應用于谷物、飼料、嬰兒食品等基質中的單端孢霉烯類真菌毒素多目標檢測。采用多功能凈化柱結合LC-MS/MS方法同時檢測糧谷制品(小麥粉、玉米粉)中的4種單端孢霉烯類真菌毒素：T-2毒素、HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ZEA。

1 材料與設備

1.1 試驗材料

試驗樣品：不同品牌不同產地的7種小麥粉、玉米粉。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(5 mg)、玉米赤霉烯酮(5 mg)、T-2毒素(5 mg)、HT-2毒素(100.0±0.20 μg/mL)，均用甲醇溶解并定容至10.0 mL作為標準儲備液，濃度為100 μg/mL，于 4 ℃條件下避光保存；10 mmol/L乙酸銨溶液，乙酸銨為色譜純。

1.2 儀器設備

液相色譜-質譜聯用儀：Agilent 1200-ESI 6410，美國安捷倫公司；Mycosep?226、Mycosep?227多功能凈化柱：Pribolab；BF-2000氮氣吹干儀：北京八方世紀有限公司；SUPER SERIES超純水系統：艾科普。

2 試驗方法

2.1 樣品前處理

2.1.1 毒素提取

稱取小麥粉或玉米樣品25.0 g (精確至0.1 g)于500 mL具塞錐形瓶中, 加入100 mL乙腈/水(84∶16，V/V)提取液，浸泡15 min，超聲震蕩40 min，過濾，取8 mL 濾液，過MycoSep?227或MycoSep?226多功能柱，取過柱后液體4 mL，N2吹干，甲醇溶液定容至1 mL。

2.1.2 多功能柱的選擇和樣品凈化

根據已有研究[18-19]，選取Mycosep?226、Mycosep?227柱進行樣品凈化，將2種多功能凈化柱的過柱效果進行比較。

選取1種面粉樣品作為空白，按照2.1.1的方法進行樣品提取，取8 mL的濾液后，向面粉中加入不同濃度梯度的4種真菌毒素標樣，分別過Mycosep?226、Mycosep?227柱，進行過柱效果比較試驗，用方差分析比較其是否存在差異。

2.2 液相色譜-質譜條件的選擇

2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)。

保持流速(0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min)、柱溫(30、40、50、60 ℃)及流動相比例3個條件中的其中2個不變，改變另外1個，測定濃度為100 ng/mL的4種真菌毒素混合標準溶液的色譜峰面積，確定出最佳的流速、柱溫及流動相比例。

2.2.2 質譜條件

離子源: 電噴霧離子源，離子源溫度: 300 ℃；干燥氣流速: 6 L/min；離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負離子模式(ESI-)；質譜掃描方式：多反應檢測(MRM)；掃描范圍：100～500 amu；用SIM 選擇離子掃描做定量分析；離子駐留時間：300 msec；霧化氣壓力為15 psig(1 psig=6 894.76 Pa)。

在試驗條件一定的情況下，分別以正離子模式和負離子模式對4種真菌毒素進行檢測，毛細管傳輸電壓在2 000～5 000 V的范圍內，碎裂電壓在 50～250 V之間選擇；并在MRM監測下，選擇4種真菌毒素監測的子離子峰出峰狀態最好時的碰撞能量值。

2.3 4種真菌毒素的定量分析

2.3.1 方法的線性范圍及定量限

以本方法確定的試驗條件，將配置的混合系列標準溶液進行測定，以峰面積(Y)對相應真菌毒素的濃度(X)繪制標準曲線進行回歸分析，得到線性回歸方程、線性范圍及相關系數。

如2.1.1的方法，準確稱取若干份相同的面粉樣品各25 g，向面粉中添加4種真菌毒素標準溶液，并逐步減少添加量，降低面粉中4種真菌毒素的濃度，處理后上機檢測。直到在儀器信噪比為3∶1 時，SIM 掃描中選擇離子不再有峰出現，此時面粉中4種真菌毒素的濃度即為方法的檢出限(LOD)；再根據儀器信噪比為10∶1 時計算定量下限(LOQ)。

2.3.2 方法的回收率與精密度

如2.1.1的方法，準確稱取若干份相同的面粉樣品各25 g，向面粉中加入與2.1.2中等量的不同濃度梯度的4種真菌毒素標樣，混勻，靜置0.5 h。按上述建立的方法對毒素進行提取、MycoSep?226柱凈化、上機檢測。同時對不加毒素的面粉樣品進行檢測。每1個樣品做3個平行，重復測定3次。通過結果計算回收率，并計算相對標準偏差(精密度)。

2.4 面粉樣品及糧谷制品的檢測

選取不同產地、不同品牌的7種小麥粉、玉米粉樣品：5種小麥粉，2種玉米粉；7種面粉的采購地點有4種為大型超市，3種為集貿市場散稱面粉。7種面粉樣品分別稱取25 g，如2.1.1的方法提取、凈化，上機檢測，每個樣品做3個平行，重復測定3次。

3 結果與分析

3.1 多功能柱的選擇

選取一種面粉樣品作為空白進行過柱效果回收率實驗的結果見表1，通過對結果進行方差分析，結論如下：對于DON、HT-2、T-2毒素，Mycosep?226、Mycosep?227的差異并不顯著(P>0.05)：DON的過柱效果Mycosep?227略優于Mycosep?226；HT-2和T-2 則是采用Mycosep?226柱效高。對于ZEA，Mycosep?226、Mycosep?227的差異極顯著(P<0.01)，Mycosep?226的回收率明顯高于Mycosep?227。綜合4種單端孢霉烯類真菌毒素同時凈化的柱效分析，Mycosep?226柱為最優選擇。

表1 不同多功能柱的回收效率比較

3.2 液相色譜-質譜條件

3.2.1 液相色譜條件

經過試驗可得，最適柱溫40 ℃，進樣量為20 μL。流動相采用乙酸銨水溶液(A)-乙腈溶液(B)體系，流速為0.3 mL/min，梯度條件：0～0.1 min，B為10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B為80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。

3.2.2 質譜條件

4種真菌毒素的質譜參數見表2。

表2 4種真菌毒素的質譜參數

注：*為定量離子。

3.2.2.1 DON正負離子掃描模式的選擇

4種真菌毒素同時檢測的條件下，當DON的電離模式為ESI-時，母離子為295，此條件下DON出峰的峰形較差，響應值較低。改用ESI+電離模式監測，DON可以加和鈉離子，母離子為319，峰形有很大改善，且響應值增大，所以確定其質譜條件為ESI+電離模式，母離子為319。

DON含羧基可以使用負離子模式，因為在一般情況下可以電離為R-COO-；但在乙酸銨存在的流動相中，羧酸根不容易電離成負離子，這時負離子監測的靈敏度下降，所以在正離子ESI+電離模式峰形較好，響應值較高。

3.2.2.2 毛細管傳輸電壓對ZEA質譜檢測的影響

毛細管傳輸電壓是加在毛細管入口端的電壓。正離子模式電壓范圍2 000～5 500 V，負離子模式一般2 000～4 000 V，根據化合物極性及利于電離的原則可適當調高或調低，半圓柱體形電極和毛細管之間的電位差是恒定的500 V(正離子模式，前者電壓高，負離子模式，后者電壓高)，若毛細管傳輸電壓過高，導致半圓柱體形電極電壓過高，易產生放電破壞化合物，從而影響其監測結果。

質譜條件優化過程中，正離子模式下毛細管傳輸電壓在2 000～5 500 V的改變對3種真菌毒素(DON、HT-2、T-2)的檢測結果影響不顯著，只需改變碎裂電壓和碰撞能量來優化檢測條件；但負離子模式下毛細管傳輸電壓的改變對ZEA的出峰情況有顯著影響，經試驗證明，毛細管傳輸電壓在2 000～4 000 V的范圍內選擇，2 500 V時ZEA的出峰情況最好。因此，正離子模式(ESI+)毛細管傳輸電壓選擇4 000 V；負離子模式(ESI-)毛細管傳輸電壓選擇2 500 V。

3.3 4種真菌毒素的定量分析結果

3.3.1 方法的線性范圍及定量限

以峰面積(Y)對相應真菌毒素的濃度(X)繪制標準曲線進行回歸分析(見表3)，結果表明4種單端孢霉烯類真菌毒素在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數在0.995以上，定量下限5～20 μg/kg。4種真菌毒素在測定方法定量限時的標準溶液TIC圖見圖1。

表3 4種單端胞霉烯族真菌毒素的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量下限

圖1 4種單端孢霉烯類真菌毒素標準溶液的TIC圖

3.3.2 方法的回收率與精密度

本方法采用4種單端孢霉烯類真菌毒素最低的面粉作為空白樣品基質，測定其精密度及回收率，結果見表4，3個加標水平下平均回收率為73.19%～107.39%，相對標準偏差為1.46%～13.24%，符合痕量分析的要求。

3.3.3 樣品提取環節對方法回收率影響的分析

根據3.1過Mycosep?226柱得到的4種毒素的回收率(提取后序環節回收率)結果與3.3.2過Mycosep?226柱得出的整個分析方法4種毒素回收率(方法回收率)的結果進行比較，用方差分析的方法分析樣品提取環節對4種真菌毒素回收率的影響。若P>0.05，則差異不顯著，即樣品提取環節對方法回收率影響不大；P<0.05，則差異顯著，說明樣品前處理環節對方法回收率影響顯著。

表4 4種單端孢霉烯類真菌毒素添加回收率和精密度

樣品前處理包括樣品提取和過柱凈化，2.3.2方法回收率的測定是在樣品前處理時就加入4種真菌毒素的標樣，2.1.2則是在過柱之前添加，兩者結果相比較，則可檢驗出樣品提取環節對方法回收率的影響。結果見表5：4種真菌毒素在過柱前添加標樣測定回收率的值與方法回收率的值相比都有顯著差異， HT-2和T-2差異極顯著。這說明在樣品提取環節4種真菌毒素均有不同程度的顯著損失。本試驗選取了已有研究中最優的提取方法，但樣品提取環節仍有顯著損失，開發新的提取方法將損失降到最低可作為今后的研究方向。

表5 提取后序環節回收率和方法回收率的比較

注:P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.000 1為差異極顯著。

3.4 面粉樣品及糧谷制品的檢測

對7種小麥粉、玉米粉樣品進行檢測，DON，HT-2，T-2 3種真菌毒素的檢出率為100%，僅1、3、4、5號面粉樣品中檢出含有ZEA，且4號集貿市場所購細玉米粉中4種真菌毒素含量均為最高。

GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》中對小麥、玉米、大麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON和玉米赤霉烯酮ZEA做了限量，要求 DON≤1 000 μg/kg，ZEA≤60 μg/kg，由表6可知，3、4號玉米粉的ZEA均超過國家限量標準。但至今為止，我國尚未出臺HT-2、T-2限量的具體標準，基于對實際檢測的應用需要，我國對HT-2、T-2等真真菌毒的限量標準有待完善。

表6 7種面粉樣品的檢測結果

4 結論

本研究結合使用多功能凈化柱，建立了一種同時檢測糧谷制品中4種單端孢霉烯類真菌毒素的液相色譜-質譜聯用的方法。結果表明，多功能凈化柱Mycosep?226對4種真菌毒素的同時凈化效果優于Mycosep?227，能使4種真菌毒素均達到較高的回收率，而Mycosep?227柱僅對其中3種效果較好，綜合考慮，Mycosep?226為最優選擇。此外，該方法對于單端孢霉烯類真菌毒素的多目標檢測，具有快速、靈敏、準確的特點，適用于糧谷制品(如面粉等)中4種真菌毒素的同時測定，也為其他基質中多種單端孢霉烯類真菌毒素多目標同時檢測提供了參考。

從樣品檢測的結果看，隨機抽取的7種樣品有2種ZEA超標，且DON，HT-2，T-2這3種真菌毒素的檢出率為100%。由此可見，我國對于控制糧谷制品中單端孢霉烯類真菌毒素含量的監管力度有待加強，相關限量標準有待完善。

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Determination of Four kinds of Trichothecenes in Grain-products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Zhang Jianing Ding Ke Guo Simeng Han Tao Chen Xiangning

(Department of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing 102206)

A simultaneous determination method for four kinds of trichothecenes in grain-products was established using high performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were sequentially extracted by 84% acetonitrile-water solution，and then the extracts were cleaned up with Mycosep?226，separated by Agilent ZORBAX Bonus-RP column and detected by LC-MS/MS. Results indicate as follows：high correlation coefficients(r ≥ 0.995)of four trichothecenes were obtained within their respective linear ranges, and the detection limit for them ranges from 2 to 5 μg/kg；and the average recovery rates in the above three matrices spike at three levels were between 73.19%～107.39%，with a relative standard deviation (RSD) varying from 1.46% to 13.24%. This indicates that this method was of good purification effect and high sensitivity, and suitable for the simultaneous detection of four kinds of trichothecenes in grain-products.

trichothecenes，LC-MS/MS，grain-products

TS201.6

A

1003-0174(2016)12-0153-06

北京市自然科學基金(14L00184)，北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃(CIT&TCD2015 4045)，北京市重點建設學科資助(PXM2009_014207_078172)，2015年北京農學院學位與研究生教育改革與發展(2015YJS034)

2015-03-31

張家寧，女，1990年出生，碩士，食品安全檢測技術

丁軻，男，1978年出生，副教授，博士，食品營養與安全