產脂肪酶菌株的常壓室溫等離子體誘變及高通量篩選方法的建立

曹 茜 馮鳳琴,2

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院1，杭州 310058)(浙江大學馥莉食品研究院2，杭州 310058)

產脂肪酶菌株的常壓室溫等離子體誘變及高通量篩選方法的建立

曹 茜1馮鳳琴1,2

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院1，杭州 310058)(浙江大學馥莉食品研究院2，杭州 310058)

脂肪酶由于可催化的反應種類和底物類別多，且具有位置選擇性和異構體選擇性等特點而常用于結構酯的合成和油脂改性等領域。絲孢酵母(Trichosporonsp.)是一種產脂肪酶菌種，但生產能力偏低是限制該菌實現工業化生產的重要因素。本研究利用常壓室溫等離子體(ARTP)對絲孢酵母野生菌進行誘變處理，并建立了96孔板培養結合對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)法測定酶活力的高通量篩選方法，實現了60個突變菌株的初篩。以酶活力為篩選指標時，突變率和正突變率分別為51.7%和28.3%。8株初篩菌株的搖瓶發酵結果顯示，A13和A5的產酶提高最顯著，培養96 h后分別比野生菌增加2.64倍和1.54倍，且2個突變菌株的遺傳穩定性良好。對比研究發現，突變菌株A13相較野生菌的最大優勢在于提前24 h便能達到最高產酶量。

絲孢酵母 脂肪酶 常壓室溫等離子體 誘變 高通量篩選

脂肪酶(EC 3.1.2.3)是最常見的生物催化劑之一，能夠水解三酰甘油酯，生成游離脂肪酸、二酰甘油酯、單酰甘油酯和甘油。事實上，脂肪酶不但能夠催化水解反應，還能催化各種合成反應，包括酯化、酯交換、酸解、醇解和氨解等[1-2]。由于脂肪酶可催化的反應種類和底物類別多，因而已廣泛應用于食品、藥物、飼料、化妝品、清潔劑等領域[3]。此外，相比于化學法催化，酶催化能在較低溫度下進行，更重要的是，脂肪酶具有底物專一性、位置選擇性和異構體選擇性等特點，在結構酯的合成和油脂改性等反應中催化生成的副產物少，降低了后續分離純化的難度。

微生物產脂肪酶因其多樣的催化能力、產量高、便于基因操作、生產無季節波動、在廉價的培養基上菌體即可快速生長、批量生產容易等優點，比植物種子和動物體內的脂肪酶應用更為普遍[4]。產脂肪酶的微生物種類較多，細菌、放線菌、酵母和霉菌均有報道[5]，本研究所涉及的菌株為絲孢酵母(Trichosporonsp.)，該類菌所產脂肪酶的分子質量在28～55 ku之間[6-9]。

國內對于絲孢酵母脂肪酶的報道較少，少數涉及誘變的研究主要利用紫外和化學誘變劑等傳統方法，張苓花等[10]利用紫外和硫酸二乙酯的復合誘變將一種絲孢酵母的胞外酶活提高了76%，宋欣等[11]通過紫外和亞硝酸的復合誘變篩選到酶活提高155%的菌株。但生產能力偏低仍然是該類菌實現工業化生產的瓶頸，為獲取高產能力的菌株，本課題組嘗試利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變絲孢酵母野生菌。ARTP利用氦氣輝光放電產生的等離子體射流作用于微生物，對菌株的遺傳物質造成損傷，細胞因此啟動的修復過程中會產生大量的錯配位點，并最終穩定遺傳進而形成突變株。ARTP具有射流溫度低、對菌株無熱損傷、無需真空裝置、對生物大分子作用明顯等優點[12-13]，是一種獲得非轉基因突變體的新型快速誘變技術。

ARTP作用后可產生種類豐富的突變庫，這對篩選到目標菌株是非常有利的，但同時也給篩選工作造成了較大的壓力。傳統的解決方法是利用搖瓶發酵逐個培養，工作量相當巨大。因此，建立有效的快速篩選方法極為重要。本研究試圖通過在96孔板上實現培養發酵和酶活測定來建立高通量的篩選方法，從而完成對ARTP作用后絲孢酵母突變體的篩選，以期獲得高產脂肪酶的突變菌株并為其他快速篩選研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 菌株

試驗菌株為本實驗室自油污土壤樣品(采自浙江杭州)篩選分離后保存，經26S rDNA核苷酸序列測定鑒定為絲孢酵母(Trichosporonsp.)。

1.1.2 培養基

斜面和平板培養基：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉14 g/L；種子培養基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；發酵培養基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，橄欖油10 mL/L。

1.1.3 主要試劑

對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP，≥98%)和Trizma?base(≥99.9%)：Sigma-Aldrich 有限公司(St. Louis, USA)；對硝基苯酚(p-NP，分析純):阿拉丁試劑(上海)有限公司；酵母浸出粉和蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設備

ARTP-Ⅱ型誘變育種系統：無錫思清源生物科技有限公司；Multiskan Mk3型酶標儀：Thermofisher(上海)儀器有限公司；恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；H1650-W型高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 ARTP誘變

1.2.1 菌懸液的制備

從絲孢酵母的斜面接一環至種子搖瓶(裝有50 mL種子培養基的250 mL錐形瓶)，于30 ℃振蕩培養48 h，恒溫振蕩器的振速為200 r/min。培養完畢后，取1 mL菌液離心并去上清，向菌體沉淀中加入1 mL生理鹽水(質量濃度為8.5 mg/mL)重懸，制得待照射的菌懸液。

1.2.2 誘變方法和條件

將10 μL菌懸液(含菌量為2.40×107cfu/mL)均勻涂布于已灼燒滅菌的載片上，并將載片置于氣流端口2 mm處，等離子體的工作氣體為高純氦氣，氣流量10 SLM，處理功率120 W，處理時間分別為0、30、60、90、120、150和180 s。在該條件下，等離子體溫度小于40 ℃。樣品處理完畢后，將載片放于1 mL生理鹽水中振蕩1 min以洗脫菌體，適量稀釋后取100 μL涂布于平板，于30 ℃下培養后計數.

1.3 高通量篩選方法

1.3.1 多孔板初篩

96孔板中每孔加入200 μL發酵培養基，將平板上生長出的菌落用1 μL接種環接種到各孔中培養，每個菌落各接3孔為3個平行試驗。將接菌后的96孔板固定于恒溫培養振蕩器中，在30 ℃、200 r/min的條件下培養發酵。每隔12 h取樣5 μL至另一96孔板測定發酵液的酶活，測定方法如下：每孔中除移入的樣品外，另加入100 μL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L, pH=8)和5 μL p-NPP(3 mg/mL，溶劑為乙腈)，反應混合物在150 r/min、40 ℃的條件下反應30 min，利用酶標儀在405 nm下測量各孔的吸光度，比較突變菌株和野生菌的測量值，計算出相對酶活。

1.3.2 搖瓶復篩

將96孔板篩選出的高產脂肪酶突變株各接種一環至發酵搖瓶(裝有50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶)以復篩出最優菌，每個突變株做3個平行試驗。各搖瓶在轉速為200 r/min、溫度為30 ℃的振蕩器中培養，每隔24 h取樣1 mL，10 000 r/min離心5 min后取上清液即為粗酶液，測定其活力。酶活力測定采用p-NPP為底物的方法[14]，并根據目標脂肪酶的反應條件做了少量修改：2.1 mL Tris-HCl緩沖液、200 μLp-NPP和100 μL適當稀釋的酶液(緩沖液與底物的濃度同1.3.1節)均加入5 mL EP管中，將反應混合物于40 ℃水浴中攪拌反應10 min，反應結束后置于冰水浴中同時加100 μL ZnSO4(0.1 mol/L)以終止反應，用0.45 μm水系濾膜過濾后405 nm下比色測定。脂肪酶的1個酶活力單位(U)定義為每分鐘從底物中釋放1 μmol的p-NP所需要的酶量。

1.4 遺傳穩定性分析

為了研究誘變菌株的遺傳穩定性，將復篩出的2株高產突變株分別連續傳代5次，并將各代接種于發酵搖瓶培養96 h，測定各代發酵液的脂肪酶活力和菌體的生物量。酶活力的測定方法同1.3.2節；生物量的測定采用干重法：取1 mL發酵液至已經稱重的2 mL EP管中，10 000r/min離心5 min后保留菌體沉淀，將沉淀用生理鹽水清洗3次，105 ℃下烘干至恒重，測定菌體干重。

1.5 發酵特性對比研究

將野生菌及2株突變菌株各接種一環至種子搖瓶中培養，每隔12或24 h取樣1 mL測定生物量，用以繪制生長曲線。生物量的測定方法同1.4節。

取培養36 h的3株菌的種子液1 mL至發酵搖瓶中發酵產酶(接菌量為2%)。每隔12或24 h取樣1 mL，10 000 r/min離心5 min后保留上清液和沉淀，用以測定酶活力和生物量，測定方法分別同1.3.2節和1.4節。

1.6 數據處理

1.6.1 突變率計算

將96孔板篩選測定的相對酶活大于120%或者小于80%的菌株定義為突變株，產酶提高的突變株定義為正突變?？偼蛔兟?(突變菌株數/總菌株數)×100%；正突變率=(產酶提高的突變菌株數/總菌株數)×100%。

1.6.2 統計分析

利用SPSS 17.0對遺傳穩定性測定結果進行單因素方差分析，α=0.01。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變的致死率曲線

等離子體產生的活性粒子除了能夠破環微生物的細胞壁和細胞膜，還能夠到達細胞內部，顯著作用于遺傳物質，從而造成大部分微生物死亡[15-16]。但少數菌體卻能夠通過自身的修復機制存活下來，這些存活下來的菌體由于遺傳物質發生了部分改變，可能引起表型的變化，因此能為不同目標的篩選提供豐富的突變庫。

如圖1所示，ARTP對絲孢酵母具有明顯的作用效果，只需照射30 s就能夠達到85.4%的致死率，之

后的致死率增長雖然變緩，但在30 s到120 s之間時，處理時間與致死率仍然存在明顯的正相關，120 s之后，致死率穩定在98%以上，到180 s時達到99.8%。隨機性是非轉基因突變的最大特點，致死率和正突變率的關系并不十分清楚，主要取決于誘變方法和菌株本身的特性[17]。本研究選擇了致死率在98%以上的受試樣品中篩選高產脂肪酶的目標菌。

圖1 ARTP對絲孢酵母的致死率曲線

2.2 突變菌株的高通量篩選

觀察在平板上生長出的菌落形態，無論是否經過ARTP處理以及處理時間的長短，菌落形態都沒有發生明顯的變化：白色，表面突起，有明顯的皺褶。因此，不能將形態改變作為篩選參考，這就更突顯了建立高通量篩選方法的重要性。

利用堿滴定脂肪酶水解乳化油脂單位時間釋放的游離脂肪酸的量為傳統的測定脂肪酶活力的方法[18]，該方法操作相對復雜，很難實現高通量的篩選。p-NPP是由棕櫚酸和p-NP結合生成的一種酯類，當作為脂肪酶的催化底物時，可水解產生p-NP，其在405 nm具有最高吸收峰，且吸光度的大小與濃度在一定范圍內成正比，因此能夠用于反應脂肪酶的水解活力。由于該法操作簡便、靈敏度高，可用于構建產脂肪酶微生物快速篩選的方法。

注：96孔板發酵48 h，虛線表明增長或減少20%。

圖2顯示了60株誘變后菌株相對于野生菌產酶的酶活力大小，野生菌的相對酶活為1，與虛線位置的比較可以發現，許多菌株都發生了顯著的變化。通過計算得出，ARTP對絲孢酵母的突變率為51.7%，其中正突變率為28.3%。在17株正突變菌株中有8株菌的產酶提高超過35%，其編號分別為A5、A11、A13、B1、B20、C7、C11和C13，將這8株菌和野生菌分別轉接于發酵搖瓶培養，以進一步篩選出最優菌株。

每24 h從發酵搖瓶中取樣測定脂肪酶活力，結果如圖3所示。在搖瓶發酵中，培養48 h后各菌株開始產酶，但此時所產酶量較少，且差異不顯著，之后進入快速產酶階段，到72 h時，產酶的差異逐漸表現出來。通過計算得出：搖瓶發酵72 h后，A13的酶活比野生菌增長5.14倍，A5增長1.55倍，增長最少的C11提高了30.4%；發酵96 h后，由于野生菌的胞外酶增速積累，這個差距得以縮小，但A13仍比野生菌發酵液的酶活增長2.64倍，A5增長1.54倍。顯著的酶活提高表明，ARTP確實對絲孢酵母產生了有效的生物作用，使得一些突變株的產酶能力得以明顯改變。

圖3 野生菌與8株突變株的搖瓶發酵復篩酶活

比較搖瓶發酵和96孔板發酵結果可以得出，由96孔板篩選出的高產菌株在搖瓶中也表現出產酶顯著提高，這表明快速篩選方法是可靠的，而且可能由于多孔板中加入的培養基較少，使得依靠橄欖油作為碳源的時間提前，發酵48 h時就有明顯的產酶，這說明快速篩選不僅體現在同時可篩的數量較多，也體現在發酵時間的縮短。但96孔板培養也存在一些弊端，由于體系縮小，營養成分、氧氣等都會不同程度地限制產酶量，并且這些限制因素隨著菌株的產酶能力越高表現得越突出。因此，多孔板培養可作為初篩，在縮小目標菌范圍后利用搖瓶發酵確定最佳突變株。

2.3 高產突變株的遺傳穩定性

經過多孔板和搖瓶發酵2輪篩選之后，得到了2株產酶較優的突變株，即A5和A13。由于可遺傳的變異對于發酵工程才是有意義的，因此本研究從生物量和產酶2個方面研究了這2株菌的遺傳穩定性。

圖4a顯示了A5連續傳代5次后各代在搖瓶發酵中的生物量和產酶情況。由圖可知，生物量和胞外酶活力雖都略有起伏，但整體表現穩定，并未出現明顯的衰退。為了進一步確認，利用SPSS 17.0對這5代的結果進行單因素方差分析。各代的生物量在99%的置信區間內差異不顯著(P=0.029>α)，酶活的差異同樣不顯著(P=0.087>α)。

A13的遺傳穩定性也同樣進行了驗證，如圖4b所示，突變株A13的生物量和酶活在傳代過程中整體表現平穩，根據方差分析的結果，各代間生物量的顯著性為0.082，酶活的顯著性為0.055，均大于0.01，這表明在該置信區間內差異不顯著，突變株A13也具有良好的遺傳穩定性。

圖4 突變株的遺傳穩定性

2.4 野生菌及突變株的發酵特性

為了進一步探究突變株A5和A13與野生菌的差異性，本課題組詳細研究了3株菌的生長和產酶特性。種子培養基中各菌的生長曲線如圖5所示，野生菌和突變株的生長趨勢及生物量并無顯著差異，均是在12 h后進入對數期，48 h后進入穩定期。將培養36 h的種子液接入發酵搖瓶中發酵產酶，3株菌的生長和產酶情況如圖6所示，與圖5相比，由于對數期種子液的作用，菌株生長沒有出現明顯的遲緩期，值得一提的是，48 h后3株菌的生物量積累并未完全停止，而是繼續緩慢增長，這很可能得益于橄欖油繼續提供碳源。對比生長曲線和產酶曲線可以發現，48 h后生長放緩的同時，產酶則開始快速積累，突變株A13產酶的增速尤為突出，96 h后逐漸達到平衡，但此刻野生菌的胞外酶卻加速積累，這使得發酵120 h后3株菌的產酶并無明顯差異。對比研究表明，突變株A13的最大優勢在于將達到最高產酶的時間提前了24 h。

圖5 野生菌和突變株在種子培養基中的生長曲線

圖6 野生菌和突變株在發酵培養基中的生長和產酶曲線

3 結論

本研究采用一種新型的突變技術ARTP對產脂肪酶絲孢酵母進行誘變，這是首次將該技術應用于絲孢酵母屬。對60株經等離子體照射后存活的菌株進行篩選，以酶活力作為篩選指標，突變率為51.7%，正突變率為28.3%，突變效果良好。

為了提高篩選效率，建立了96孔板初篩結合搖瓶發酵復篩的高通量篩選方法。若1個菌株做3次平行試驗，1塊96孔板可最多同時篩選32株菌，大大縮短了篩選周期；意外的收獲在于，在小體積發酵中，該菌的產酶時間比搖瓶發酵提前，這進一步縮短了篩選時間。但由于96孔板對于菌株產酶能力的完全表現存在一定的制約，因此將篩選出的8株較優菌通過搖瓶發酵進行驗證，從中篩選出了2株最優突變株A13和A5，培養發酵96 h之后，A13產酶提高2.64倍，A5提高1.54倍。在連續傳代5次之后，這2株突變菌株在生物量和產酶能力方面表現出良好的遺傳穩定性。

進一步的對比研究發現，在48～96 h期間，A13和A5的產酶一直高于野生菌，但這之后野生菌更快的產酶速度使得在120 h時3株菌的產酶量無差異。這表明，產酶時間提前才是突變株的最大優勢，A13達到最大產酶量的時間比野生菌提前了24 h。

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Mutagenesis of Atmospheric and Room Temperature Plasma for Lipase-Producing Strain and Establishment of High Throughput Screening Method

Cao Xi1Feng Fengqin1,2

(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University1, Hangzhou 310058)(Fuli Institute of Food Science, Zhejiang University2, Hangzhou 310058)

Because of various reaction types, substrates, regioselectivity, isomer selectivity and other features, lipases have been widely used in a multitude of fields, especially structure lipids synthesis and oil modification. Trichosporon sp. is a kind of lipase-producing strain, but relatively low yield limits its industrial production. The atmospheric and room temperature plasma (ARTP) were used to conduct mutagenic treatment on trichosporon aquatile wild mushroom and a high throughput screening method using 96-well plates was set up; in this protocol, enzyme activity of fermented broth was measured byp-nitrophenylpalmitate (p-NPP) method, preliminary screening of 60 mutant strains were finished. The mutation rate were positive mutation rate were 51.7% and 28.3% respectively when enzyme activity was regarded as the screening index. According to the results of shake-flask fermentation of 8 preliminary screening strains, enzyme yields of A13 and mutant A5 were prominent which were respectively 2.64 and 1.54 times higher than that of the wild strain after 96 h cultivation. And both of them showed good genetic stability. Compared with wild strain mutant A13 reached the plateau of yield of enzyme 24 h ahead of time, which is the most important advantage to this mutant.

Trichosporon aquatile., lipase, atmospheric and room temperature plasma, mutagenesis, high throughput screening

TQ925+.6

A

1003-0174(2016)02-0052-06

浙江省重大科技專項(2012C12005-2)

2014-06-26

曹茜，女，1988年出生，博士，食品科學

馮鳳琴，女，1964年出生，教授，博士生導師，食品化學與食品生物技術