電化學生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的研究進展

馬海華 張 元 甄 彤 孫楫舟 夏善紅

(傳感技術國家重點實驗室 中國科學院電子學研究所1，北京 100190)(中國科學院大學研究生院2，北京 100080)(河南工業大學信息科學與工程學院3，鄭州 450001)(糧食信息處理與控制教育部重點實驗室4，鄭州 450001)

電化學生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的研究進展

馬海華1，2，3，4張 元1，4甄 彤3孫楫舟1夏善紅1

(傳感技術國家重點實驗室 中國科學院電子學研究所1，北京 100190)(中國科學院大學研究生院2，北京 100080)(河南工業大學信息科學與工程學院3，鄭州 450001)(糧食信息處理與控制教育部重點實驗室4，鄭州 450001)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產物，具有劇毒性和嚴重的致癌性、致畸性和致突變性，攝入受黃曲霉毒素污染的農作物和食品會對人類和動物的身體健康造成極其嚴重的危害。基于十年來國內外的研究成果，從電化學傳感機理方面概述了電化學生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的發展現狀和應用前景，介紹了各類電化學生物傳感器的工作原理、制備方法和檢測性能。電化學生物傳感器相比于傳統的黃曲霉毒素檢測方法，具有檢測時間短、操作簡單、成本低、便于微型化等優勢。金納米顆粒、碳納米管等納米材料的使用將進一步提高電化學生物傳感器的靈敏度以及抗原或抗體的固定效率。超微電極技術、傳感器陣列技術以及微流控技術的應用也將進一步提高電化學生物傳感器在毒素檢測中的性能。

黃曲霉毒素 電化學 生物傳感器 免疫分析 納米材料

霉菌毒素是真菌的次級代謝產物，在自然界中廣泛存在，攝取、吸入或通過皮膚吸附霉菌毒素，可以使人或動物的機能下降、致病、甚至死亡。在400多種不同的霉菌毒素中，黃曲霉毒素(aflatoxin)，尤其是黃曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最強的一種霉菌毒素。黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產物，已經能夠分離并識別的有18種。它們由C、H、O 3種元素組成，化學結構非常類似，分子中均含有1個雙呋喃環和1個香豆素。在各種黃曲霉毒素中，最主要的4種是黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，即AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。當牛攝入含AFB1的飼料后，會在體內通過肝微粒體酶作用而被羥基化，轉變成黃曲霉毒素M1(AFM1)，存在于牛的乳汁中。

黃曲霉毒素具有劇毒性和嚴重的致癌性、致畸性、致突變性，且能夠抑制機體的免疫力，特別是引起肝臟的慢性或急性損害。1993年，國際腫瘤研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2歸為1類致癌物，AFM1歸為2B類致癌物。2002年，IARC專論中指出，AFB1暴露是引發人類原發性肝癌的一個主要危險因素[1]，痕量AFB1即可造成人類或動物的急性中毒死亡或慢性累積致癌等極其嚴重的危害。

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，能夠在產前、產后、加工、儲存等多個環節污染多種農作物和食品，如花生、谷物、玉米、大米、堅果、飼料、牛奶等。人們通過攝入被黃曲霉毒素污染的糧食造成直接暴露，或通過食用動物產品造成間接暴露。長期攝入被黃曲霉毒素污染的食品，即使黃曲霉毒素濃度很低，由于其在體內累積，也會威脅到人們的健康，造成肝臟損傷，甚至死亡。

由于黃曲霉毒素的熱穩定性非常好，一旦形成很難遭到破壞，另外，就現有的農業和食品生產流程條件來看，無法徹底避免食品及飼料中的黃曲霉毒素，所以發展和建立健全對黃曲霉毒素的監控和檢測就顯得尤為重要。為此，大多數國家都制定了食品中黃曲霉毒素的限量標準。其中，歐盟制定的標準最為嚴格[2]，規定在直接人類消費品谷物、花生和干果中AFB1的最高限量為2 μg/kg，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2總和最高限量為4 μg/kg，牛奶中AFM1的最高限量為0.05 μg/kg。我國衛生部也頒布了食品中黃曲霉毒素的最高限量標準[3]，其中規定了AFB1的限量標準，沒有針對總量的限制要求。

目前，我國國家標準中采納的檢測黃曲霉毒素的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法和免疫親和層析凈化熒光光度法等。雖然這些方法被廣泛采用，但是通常需要在實驗室環境下開展，所需的儀器設備價格昂貴，要求有專業技術人員操作，實驗步驟繁瑣，耗時較長。因此，近年來研究和開發低成本、快速、簡單、靈敏、特異性好的生物傳感器得到了越來越廣泛的關注。

生物傳感器主要包含2個重要單元：生物識別單元(如抗體、酶等)和換能器(如電極、光波導和懸臂梁等)[4]，如圖1所示。生物識別單元與目標分子之間一般具有特異性結合的親和性，使生物傳感器通常具有很高的選擇性。換能器與生物識別單元緊密接觸，同時又與數據接收和處理系統相連，它將生物識別單元產生的信號轉換成電信號或光信號等可測量的信號。

圖1 生物傳感器的組成

基于免疫分析的生物傳感器使用抗原或抗體作為生物識別單元。由于黃曲霉毒素是小分子物質，屬于半抗原，所以，為了便于固定以及與抗體結合，通常需要將其與牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)形成結合物(如BSA-AFB1)。為進一步放大響應信號，有時需要對抗原或抗體進行標記，例如用酶標記抗原或抗體，能夠起到對電流信號的級聯放大作用[5]，因為酶是一種具有強力催化作用的蛋白質，能夠催化底物發生酶促氧化還原反應產生電流。在黃曲霉毒素電化學免疫生物傳感器中常用作標記物的酶有：堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)[6-10]和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)[11-18]。除了基于抗原-抗體的免疫分析之外，黃曲霉毒素生物傳感器也可以將乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)作為生物識別單元[19-22]，利用黃曲霉毒素對AChE的抑制作用來制備。

換能器在生物傳感器檢測過程中發揮著重要作用，根據信號轉換方式的不同，換能器可以是電化學、光學、壓電、微機械、熱感應或磁性元件中的一種或幾種的結合。其中，基于電化學原理的生物傳感器占有非常重要的地位，是應用最廣泛、種類最多和商用最成功的一類生物傳感器[23]，具有選擇性好、成本低、操作簡單、易于微型化等特點。電化學生物傳感器可以基于抗原和特定抗體間的高親和性反應，也可以基于酶的催化氧化或酶活性的抑制等生物反應機理。該類傳感器將生物反應轉換為可測量的電信號，常用的換能器一般是三電極系統，包含工作電極、對電極和參比電極。工作電極上通常修飾導電和生物敏感材料，用于識別目標分析物，常用的有金等貴金屬電極、絲網印刷電極和玻碳電極等。根據電化學檢測技術的不同，可以將電化學生物傳感器分為電流型、阻抗型、電導型和電勢型。

基于十年來國內外的研究成果，從電化學生物傳感機理、電化學測量技術以及免疫的角度綜述了電化學生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的研究現狀和應用進展。文獻報道的各種黃曲霉毒素電化學生物傳感器的機理和性能概述見表1。

1 電流型電化學生物傳感器

電流型電化學生物傳感器也被稱為安培型電化學生物傳感器，主要探測生物電化學反應中的電活性物質，在一定的電極電壓下，通過電極表面或其修飾層內氧化還原反應生成的電流隨時間的變化來測量分析物[39]。

基于免疫分析的黃曲霉毒素電流型生物傳感器通常將抗原與BSA的結合物或抗體固定在修飾電極表面，通過競爭或非競爭免疫反應使抗原-抗體結合，有時需要使用酶標記抗原、抗體或二抗，響應電流與酶的活性相關，從而與待測液中黃曲霉毒素的濃度相關。

在利用酶促反應的免疫傳感器中，常用ALP標記二抗[9-13]。Ammida等[6，10]將BSA-AFB1固定在一次性單個絲網印刷電極表面，待測液中的游離AFB1與固定在電極表面的BSA-AFB1競爭結合anti-AFB1抗體，利用ALP標記二抗作為信號放大系統，使用差分脈沖伏安法檢測ALP催化底液中1-萘基磷酸鹽產生的響應電流，電流隨AFB1濃度增大而減小。結果顯示在實際大麥樣品中的背景信號要大于在AFB1標準液中的信號，所以基質效應是實際樣品檢測中一個需要考慮的問題。Piermarini等[8-9]采用類似的方法，使用8個絲網印刷電極或含有96個絲網印刷電極的96孔微板形成傳感器陣列，分析了該傳感器在實際玉米樣品中的檢測性能。相對于基于單個絲網

表1 黃曲霉毒素電化學生物傳感器

注：MAb為Monoclonal antibody；PAb為Polyclonal antibody；檢測時間指從電極接觸待測液到最后一種試劑滴加并反應完畢所需的時間，不包括電極的修飾時間和讀取信號時間。

印刷電極的傳感器來說，傳感器陣列的優勢在于能夠同時開展多個試驗，節省時間。另外，Tan等[7]利用了酶催化銀沉積的信號放大方法，BSA-AFB1固定在巰基乙胺修飾的金電極表面，二抗標記物ALP催化底液中的抗壞血酸2-磷酸酯生成抗壞血酸，銀離子被還原成金屬銀沉積在電極表面。

HRP也常用來標記抗原[11-13]和抗體[14-15]或作為封閉液封閉電極表面的活性位點[17]。Neagu等[11]、Paniel等[12]和Parker等[13]采用直接競爭免疫分析方法制備AFM1電流型生物傳感器，將anti-AFM1抗體固定在電極表面，游離的AFM1和HRP標記AFM1(AFM1-HRP)競爭結合anti-AFM1抗體，HRP催化底液的氧化還原反應，檢測響應電流。其中，Neagu等[11]用抗小鼠免疫球蛋白G抗體預活化電極表面，以增大anti-AFM1抗體的固定量并獲得更好的定向性。Parker等[13]采用光刻技術制備含有35個正方形微電極的金微電極陣列，片上集成輔助電極和參比電極，結果顯示牛奶對電極表面的干擾非常小。Paniel等[12]將anti-AFM1抗體包被在磁性納米顆粒表面，通過外加磁場將anti-AFM1抗體固定在絲網印刷電極表面，用計時電流法和循環伏安法檢測HRP在底液中產生的酶促氧化還原電流。Sun等[14]在玻碳電極表面制備了一種新型生物復合膜，包含HRP標記anti-AFB1抗體、金納米顆粒、二氧化鈦溶膠、室溫離子液和全氟磺酸。抗原-抗體結合物阻礙了HRP活性中心到電極表面的直接電子傳遞，使得HRP對H2O2催化反應產生的峰電流減小。Tang等[15]制備出一種基于磁珠和銦錫氧化物(indium tin oxide，ITO)電極的傳感器，HRP標記的anti-AFB1抗體與金納米顆粒結合，多功能磁珠作為親和性載體用來固定BSA-AFB1，競爭免疫反應后形成的生物納米復合物在外加磁場作用下聚集在ITO電極表面。該方法應用于紅甜椒樣品的檢測，與商用ELISA方法比對，獲得穩定的結果，且無需樣品的預濃縮。Owino等[17]提出一種無需標記的檢測方法，將BSA-AFB1固定在聚硫堇和金納米顆粒修飾的玻碳電極表面，用HRP封閉活性位點，免疫反應產生的抗原-抗體結合物抑制了酶的活性。

Sharma等[24]和Singh等[25]制備出一種無需酶或其他標記物的基于納米材料的傳感器，實現AFB1的快速檢測。Sharma等[24]將anti-AFB1抗體與半光胺功能化的金納米顆粒共價交聯形成anti-AFB1-C-AuNP，固定在金電極表面的自組裝單層膜上，用循環伏安法和差分脈沖伏安法檢測溶液中的AFB1。Singh等[25]將anti-AFB1抗體固定在多壁碳納米管修飾的ITO電極上，利用循環伏安法檢測。結果顯示響應電流隨AFB1濃度增大而增大[24-25]，分析原因認為，抗原和抗體的結合可促進空間定向，為到電極表面的電子轉移提供更便利的導電通道[25]，或抗原抗體復合物作為電子轉移加速層，更易于電子轉移[24-25]。但是，這與Zhou等[29]、孫秀蘭等[30]和Bacher等[36]分析結果時提到的抗原-抗體結合物阻礙電極表面的電子轉移相悖。

Masoomi等[26]提出一種基于“夾心”結構的電流型電化學生物傳感器，用金包裹Fe3O4磁芯與苯鄰二酚結合共同標記二抗，苯鄰二酚被氧化產生響應電流。通過外加磁場去除免疫復合物即可實現該傳感器的再生。“夾心”結構一般適用于檢測生物大分子，不適合于檢測霉菌毒素這樣的生物小分子[40]。所以，在已發表的黃曲霉毒素生物傳感器文獻中極少采用“夾心”結構。

不基于免疫分析的電流型生物傳感器主要利用了黃曲霉毒素對AChE的活性抑制作用[19-20]或黃曲霉毒素氧化還原酶(aflatoxin-oxidase，AFO)對黃曲霉毒素的催化氧化作用[27]，亦或不使用酶，直接利用電化學溶出分析技術[28]。

AFB1對AChE的活性抑制主要是由于AFB1與AChE活性位點入口的外圍位點結合，“堵住”了活性位點的入口，使得底物硫代乙酰膽堿無法進入到催化位點，降低了AChE的去乙酰作用，阻止了膽堿的釋放，從而抑制了硫代乙酰膽堿的水解[19]。Rejeb等[20]制備出一種基于AChE和膽堿氧化酶(choline oxidase，ChOx)的雙酶傳感器。ChOx固定在普魯士藍修飾的絲網印刷電極表面，AChE催化底物乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸，ChOx催化膽堿氧化生成的H2O2被電極表面的普魯士藍還原產生電流。結果顯示，AFB1濃度越高對AChE活性的抑制越大，當抑制率為20%時，檢測下限為10 ng/g。Hansmann等[19]提出一種基于單酶的傳感器，將Ee-AChE(Electrophorus electricus AChE)固定在鈷-苯二甲藍修飾的電極上，鈷-苯二甲藍氧化硫代乙酰膽堿的水解產物硫代膽堿，產生氧化還原電流。在多種AChE中，Ee-AChE對AFB1表現出的敏感性最高，等量的AFB1情況下Ee-AChE獲得的抑制率最大[19]。基于AChE活性抑制的傳感器靈敏度較低，檢測下限一般為10～100 μg/kg，只有在對測試液預濃縮的前提下才能獲得更低的檢測下限[41-42]。另外，該類傳感器對AFB1的選擇性不唯一，因為AFB1和AFB2對AChE都有較大的活性抑制作用，但是AFM1、AFG1和AFG2對AChE的抑制性很小[21]。因此，可以利用該類傳感器檢測AFB1和AFB2的總量。目前，大多數基于AChE活性抑制的生物傳感器仍處于概念驗證階段，實際檢測中具有相對局限性[42]。

Li等[27]利用AFO對AFB1的催化氧化作用制備傳感器，將AFO固定在多壁碳納米管修飾的鉑電極上，AFO作用于AFB1分子雙呋喃環的不飽和碳鍵，生成O2和H2O2。AFO是來自假蜜環菌的具有轉化分解黃曲霉毒素作用的蛋白質酶，可以與雜色曲霉素發生交叉反應[43]，所以該傳感器對AFB1的選擇性不唯一。

Hajian等[28]提出一種基于吸附陰極溶出伏安法的電流型生物傳感器。使用懸汞電極作為工作電極，AFB1和AFB2吸附在懸汞電極表面，富集時間優化為60 s，采用伏安法陰極掃描，AFB1和AFB2從陰極溶出，根據溶出電流峰測定AFB1和AFB2濃度。

2 阻抗型電化學生物傳感器

阻抗型電化學生物傳感器主要是通過檢測電極表面發生生物識別反應引起的電子轉移阻抗的變化來測量分析物。電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)是研究傳感界面電特性并跟蹤界面反應的一種有效方法。文獻報道的黃曲霉毒素阻抗型生物傳感器大多數基于免疫分析[29-32，36-37]，也有少量報道基于DNA探針[35]。這類傳感器的主要優點是一般不需要酶標記抗原或抗體[44]，也無需使用二抗放大信號，即可產生可測量的電化學信號。

Zhou等[29]使用電沉積法制備出一種石墨稀/導電聚合物/金納米顆粒/離子液復合物膜，修飾在金電極表面，固定anti-AFB1抗體。抗原-抗體結合物阻礙電子轉移，使電極表面阻抗增大。孫秀蘭等[30]采用了類似的檢測方法，使用溶膠凝膠法將anti-AFB1抗體固定在玻碳電極表面。Bacher等[36]使用一對銀絲電極組成的兩電極系統，將anti-AFM1抗體固定在電極表面的自組裝單層膜上。Li等[32]制備出一種硅膠-離子液生物相容性膜用于anti-AFB1抗體的固定，阻抗分析顯示，與不含離子液的比對電極相比，離子液的使用能夠增大玻碳電極表面的導電性，減小電子轉移阻抗。Owino等[31]將anti-AFB1抗體固定在聚苯胺和聚苯乙烯磺酸修飾的鉑圓盤電極表面，阻抗分析顯示抗體固定和BSA封閉都會阻礙電子轉移。Vig等[37]提出一種基于膠體金和電沉積銀的傳感器，固定在絲網印刷電極上的BSA-AFM1競爭結合膠體金標記的anti-AFM1抗體，在金的催化作用下，用計時電流法還原底液中的AgNO，電沉積銀在電極表面，從而改變電子轉移阻抗。

Din?kaya等[35]制備出一種基于DNA探針的阻抗型生物傳感器。該傳感器將硫醇修飾的單鏈DNA(ss-HSDNA)探針通過與金納米顆粒共價交聯固定在金電極表面形成的自組裝單層膜上，ss-HSDNA能夠識別待測液中的AFM1分子，發生特異性結合，增大電子轉移阻抗。

3 電導型電化學生物傳感器

電導型電化學傳感器有時被看作是阻抗型電化學傳感器的一個分支[45]。通常，這類傳感器不需要使用參比電極，采用一對相隔一定距離的金屬電極，電極上施加交流電壓，產生電流[46]。溶液中發生的生物化學反應會改變溶液的離子組成和離子濃度，檢測由此而引起的電極間電導變化從而確定分析物的濃度。電導型傳感器的優勢主要有：易于微型化和大規模生產，無需參比電極，驅動電勢低[18]。

Liu等[18]提出一種基于金微叉指電極和HRP的免疫傳感器。anti-AFB1抗體固定在金納米顆粒和氨基乙硫醇修飾的金微叉指電極表面，用HRP封閉剩余的活性位點。電極表面免疫反應形成的抗原-抗體結合物阻礙了固定的HRP到電極表面的直接電子轉移，抑制了酶的生物催化活性，從而影響HRP對底液中KI和H2O2的催化反應，電解質電導的變化與AFB1濃度成反比。Soldatkin等[34]制備出一種基于金叉指薄膜電極和AChE活性抑制的傳感器，并與ELISA、HPLC和TLC檢測方法進行了比對。試驗采用差分模式，使用2對電極，一對電極覆蓋無抑制反應的BSA膜作為比對電極，另一對電極覆蓋AChE膜作為工作電極。AChE催化底物的水解，使電極薄膜上的離子濃度增大，從而使溶液電導發生變化。

Ah等[33]提出一種利用硅場效應晶體管檢測不帶電或微弱帶電小分子的免疫傳感器。BSA-AFB1被固定在p型硅場效應晶體管傳感器表面源極和漏極之間的硅通道上，金納米顆粒標記anti-AFB1抗體。競爭免疫反應后被捕獲在傳感器表面的金納米顆粒通過化學金沉積迅速生長并帶負電荷，使源極和漏極之間的電導增大。試驗在干燥條件下測量金沉積反應前后的電導值，獲得的信號放大是液體環境中的100倍，而且不需要考慮待測樣品溶液的離子強度、等電點或pH值。

4 電勢型電化學生物傳感器

電勢型電化學傳感器通過檢測工作電極和參比電極之間電流為零時的電勢變化與電化學反應中離子活性的關系來測量分析物。由于在某種程度上，電勢型和電導型傳感器信噪比較低，在實際應用中不如電流型那么廣泛[44]。

Rameil等[16]采用免疫分析方法，將多克隆anti-AFM1抗體固定在聚吡咯修飾的絲網印刷電極表面，羥基苯丙酸作為向抗原標記物HRP提供電子的復合物，測試底液中含H2O2，結果顯示電勢變化隨AFM1濃度增大而減小。Larou等[38]首次研制出一種用于AFM1檢測的基于生物電識別分析的高通量電勢型細胞生物傳感器。AFM1同源抗體電植入非洲綠猴腎細胞的細胞膜中，銀絲工作電極和參考電極插入待測液中，AFM1與細胞膜中的抗體結合，使細胞膜電勢發生改變。由于使用多細胞電極接口陣列，該傳感器可實現高通量檢測，每小時完成160次獨立測試。

5 實際樣品前處理方法

實際樣品的前處理也會影響傳感器的檢測靈敏度，所以，在檢測之前需要對樣品進行預處理。相對于傳統TLC法和HPLC法，應用電化學生物傳感器的檢測方法中樣品前處理過程步驟簡單、使用有機試劑少、成本低、易于操作。對于固體樣品，如花生、玉米、大米和大麥等，前處理一般分為4個步驟[6-10，15，30]：1)將樣品磨成粉；2)加入不同濃度的黃曲霉毒素標準溶液，旋渦混合；3)加入提取液，離心機離心；4)取上清液，用緩沖溶液稀釋后待測。Zhou等[29]和Li等[32]在前處理后，取萃取物，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋5倍，混懸液手動搖晃分層后，水相層用于AFB1檢測。Piermarini等[8]增加脫脂步驟，用正己烷脫脂1次，待溶液分層后，收集水相層用于檢測。提取液一般使用甲醇、十二甲基甲酰胺和磷酸鹽緩沖溶液(70∶1∶29，V/V)[6，30]，或甲醇和水(80∶20，V/V)[7，15]，亦或甲醇和磷酸鹽緩沖溶液(85∶15，V/V)[8，10，29，32]。

對于牛奶液體樣品，前處理一般分為2個步驟[11-13，16，35]：樣品離心脫脂和加入不同濃度的AFM1標準溶液。對于奶粉固體樣品，前處理過程增加樣品溶解于緩沖溶液的步驟[36-37]。

6 展望

隨著傳感技術、材料科學、生物技術的發展，黃曲霉毒素電化學生物傳感器也呈現出一些引人注目的發展趨勢。

納米材料在電化學生物傳感器中的應用是一個重要的發展方向。納米材料，如碳納米管、金屬納米顆粒、納米線等，它們具有比表面積大、穩定性好、生物兼容性好、易于功能化、易于分散和快速制備、尺寸和形狀多樣等優點[44]。功能化的納米材料可以作為催化工具、固定平臺或電活性標記等，用于改善生物傳感器的表面特性[23]。金屬納米顆粒，特別是金納米顆粒是廣泛使用的一種納米材料。例如，金納米顆粒與聚硫堇的電聚合薄膜[17]、2-氨基乙硫醇[18]、全氟磺酸中的離子液[14]、殼聚糖[26]或石墨烯[29]共同修飾工作電極。金納米顆粒也可以與抗體結合，例如，金納米顆粒標記anti-AFB1抗體，作為催化劑催化電沉積銀[37]，或者在干燥檢測條件下放大響應信號[33]，亦或者與半胱胺一起共價交聯anti-AFB1抗體，用于抗體固定[24]。另外在DNA生物傳感器中，金納米顆粒用于固定硫醇修飾的單鏈DNA探頭[35]。碳納米管也是一種常用的納米材料，例如，多壁碳納米管修飾鉑電極，用于固定黃曲霉毒素氧化酶[27]，或者多壁碳納米管沉積在ITO電極上，用于固定anti-AFB1抗體[25]。

實現多樣品的同時檢測也是未來的一個發展方向。在傳感器陣列的不同行或不同列固定不同分析物的抗體，實現多參數或多靶標物質的同時檢測，從而提高系統通量、降低分析成本、節省時間。例如，使用96孔絲網印刷微板[8，11]或8個絲網印刷電極[9]組成的傳感器陣列，用于檢測AFB1或AFM1。但是，目前黃曲霉毒素的研究仍然停留在同一樣品的同時重復檢測。

轉換器本身性能的改進對提高電化學生物傳感器的靈敏度也具有重要的意義。微電極或超微電極的使用能夠加快傳質，加速響應時間，大大提高傳感器的靈敏度，具有許多常規電極無法比擬的優良性能。例如，使用微梳狀電極檢測AFB1[18]，或采用金微電極陣列(含有35個20 μm×20 μm的正方形微電極)與片上參考電極和對電極組成片上系統用于檢測牛奶樣品中的AFM1[13]。

另外，研究和開發用于黃曲霉毒素檢測的微流控系統和免疫芯片技術，優化分析機制，合成新型重組抗體和適體，以及研究和識別人類黃曲霉毒素暴露的獨特生物標記都將成為未來黃曲霉毒素電化學生物傳感器研究的發展方向，并將對食品安全產生深遠的積極影響。

7 結論

在文獻報道的黃曲霉毒素生物傳感器中，電化學生物傳感器成為眾多研究的焦點，與傳統檢測方法相比，電化學生物傳感器具有成本低、操作簡單、設備便于微型化、易于實現移動檢測等優勢。其中，電流型免疫傳感器是最成熟、應用最廣泛的一種生物傳感器，隨著超微電極、超微電極陣列以及電極修飾材料和技術的發展，電流型電化學生物傳感器的靈敏度和選擇性將不斷提高。阻抗型電化學生物傳感器在檢測中通常不需要酶標記抗原或抗體，也無需使用二抗放大信號，這樣避免了酶的不穩定性對檢測結果的影響，提高了傳感器的可重復性，簡化了操作步驟。電導型電化學生物傳感器不需要使用參比電極，優化了電極結構，易于微型化和大規模生產。但是，在某種程度上，電勢型和電導型電化學生物傳感器由于信噪比較低，在實際應用中不如電流型那么廣泛。

[1]Some traditional herbal medicines，some mycotoxins，naphtha and styrene[M]//IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.Lyon，France，2002(82)：195-250

[2]Commission Regulation(EC)No 1881/2006，Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs[S].2006

[3]GB 2761—2011，食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量[S]

[4]Patel P D.(Bio)sensors for measurement of analytes implicated in food safety：a review[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2002，21(2)：96-115

[5]Wolfgang S.，Electron-transfer pathways in amperometric biosensors.Ferrocene-modified enzymes entrapped in conducting-polymer layers[J].Biosensors and Bioelectronics，1995，19(1-2)：181-193

[6]Ammida N H S，Micheli L，Palleschi G.Electrochemical immunosensor for determination of aflatoxin B1in barley[J].Analytica Chimica Acta，2004(1-2)：159-164

[7]Tan Y，Chu X，Shen G L，et al.A signal-amplified electrochemical immunosensor for aflatoxin B1determination in rice[J].Analytical Biochemistry，2009(1)：82-86

[8]Piermarini S，Micheli L，Ammida N H S，et al.Electrochemical immunosensor array using a 96-well screen-printed microplate for aflatoxin B1detection[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22(7)：1434-1440

[9]Piermarini S，Volpe G，Micheli L，et al.An ELIME-array for detection of aflatoxin B1in corn samples[J].Food Control，2009，20(4)：371-375

[10]Ammida N H S，Micheli L，Piermarini S，et al.Detection of aflatoxin B1in barley：comparative study of immunosensor and HPLC[J].Analytical Letters，2006，39(8)：1559-1572

[11]Neagu D，Perrino S，Micheli L，et al.Aflatoxin M1determination and stability study in milk samples using a screen-printed 96-well electrochemical microplate[J].International Dairy Journal，2009，19(12)：753-758

[12]Paniel N，Radoi A，Marty J L.Development of an electrochemical biosensor for the detection of aflatoxin M1in milk[J].Sensors，2010，10(10)：9439-9448

[13]Parker C O，Lanyon Y H，Manning M，et al.Electrochemical immunochip sensor for aflatoxin M1detection[J].Analytical Chemistry，2009，81(13)：5291-5298

[14]Sun A L，Qi Q A，Dong Z L，et al.An electrochemical enzyme immunoassay for aflatoxin B1based on bio-electrocatalytic reaction with room-temperature ionic liquid and nanoparticle-modified electrodes[J].Sensing and Instrumentation for Food Quality and Safety，2008，2(1)：43-50

[15]Tang D P，Zhong Z Y，Niessner R，et al.Multifunctional magnetic bead-based electrochemical immunoassay for the detection of aflatoxin B1in food[J].Analyst，2009，1349(8)：1554-1560

[16]Rameil S，Schubert P，Grundmann P，et al.Use of 3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid as electron donating compound in a potentiometric aflatoxin M1-immunosensor[J].Analytica Chimica Acta，2010，661(2)：122-127

[17]Owino J H O，Arotiba O A，Hendricks N，et al.Electrochemical Immunosensor Based on Polythionine/Gold Nanoparticles for the Determination of Aflatoxin B1[J].Sensors，2008，8(12)：8262-8274

[18]Liu Y，Qin Z H，Wu X F，et al.Immune-biosensor for aflatoxin B1based bio-electrocatalytic reaction on micro-comb electrode[J].Biochemical Engineering Journal，2006，32(3)：211-217

[19]Hansmann T，Sanson B，Stojan J，et al.Kinetic insight into the mechanism of cholinesterasterase inhibition by aflatoxin B1to develop biosensors[J].Biosensors and Bioelectronics，2009，24(7)：2119-2124

[20]Rejeb I B，Arduini F，Arvinte A，et al.Development of a bio-electrochemical assay for AFB1detection in olive oil[J].Biosensors and Bioelectronics，2009，24(7)：1962-1968

[21]Arduini F，Errico I，Amine A，et al.Enzymatic spectrophotometric method for aflatoxin B detection based on acetylcholinesterase inhibition[J].Analytical Chemistry，2007，79(9)：3409-3415

[22]Puiu M，Istrate O，Rotariu L，et al.Kinetic approach of aflatoxin B1-acetylcholinesterase interaction：A tool for developing surface plasmon resonance biosensors[J].Analytical Biochemistry，2012，421(2)：587-594

[23]Pérez-López B，Merko?i A.Nanomaterials based biosensors for food analysis applications[J].Trends in Food Science & Technology，2011，22(11)：625-639

[24]Sharma A，Matharu Z，Sumana G，et al.Antibody immobilized cysteamine functionalized-gold nanoparticles for aflatoxin detection[J].Thin Solid Films，2010(3)：1213-1218

[25]Singh C，Srivastava S，Ali A，et al.Carboxylated multiwalled carbon nanotubes based biosensor for aflatoxin detection[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2013，185(1)：258-264

[26]Masoomi L，Sadeghi O，Banitaba M H，et al.A non-enzymatic nanomagnetic electro-immunosensor for determination of Aflatoxin B1as a model antigen[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2013，177(1)：1122-1127

[27]Li S C，Chen J H，Cao H，et al.Amperometric biosensor for aflatoxin B1based on aflatoxin-oxidase immobilized on multiwalled carbon nanotubes[J].Food Control，2011，22(1)：43-49

[28]Hajian R，Ensafi A A.Determination of aflatoxins B1and B2by adsorptive cathodic stripping voltammetry in groundnut[J].Food Chemistry，2009，115(3)：1034-1037

[29]Zhou L T，Li R Y，Li Z J，et al.An immunosensor for ultrasensitive detection of aflatoxin B1with an enhanced electrochemical performance based on graphene/conducting polymer/gold nanoparticles/the ionic liquid composite film on modified gold electrode with electrodeposition[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2012，174(1)：359-365

[30]孫秀蘭，汪忠云，方銀軍，等.溶膠凝膠法固定抗體制備黃曲霉毒素免疫傳感器[J].分析化學，2010(2)：245-248

[31]Owino J H O，Ignaszak A，Al-Ahmed A，et al.Modelling of the impedimetric responses of an aflatoxin B1immunosensor prepared on an electrosynthetic polyaniline platform[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，388(5)：1069-1074

[32]Li Z J，Wang Z Y，Sun X L，et al.A sensitive and highly stable electrochemical impedance immunosensor based on the formation of silica gel-ionic liquid biocompatible film on the glassy carbon electrode for the determination of aflatoxin B1in bee pollen[J].Talanta，2010，80(5)：1632-1637

[33]Ah C S，Park C W，Yang J H，et al.Detection of uncharged or feebly charged small molecules by field-effect transistor biosensors[J].Biosensors and Bioelectronics，2012，33(1)：233-240

[34]Soldatkin O O，Burdak O S，Sergeyeva T A，et al.Acetylcholinesterase-based conductometric biosensor for determination of aflatoxin B1[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2013，188(1)：999-1003

[35]Din?kaya E，Knk ?，Sezgintürk M K，et al.Development of an impedimetric aflatoxin M1biosensor based on a DNA probe and gold nanoparticles[J].Biosensors and Bioelectronics，2011，26(9)：3806-3811

[36]Bacher G，Pal S，Kanungo L，et al.A label-free silver wire based impedimetric immunosensor for detection of aflatoxin M1in milk[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2012，168(1)：223-230

[37]Vig A，Radoi A，Muoz-Berbel X，et al.Impedimetric aflatoxin M1immunosensor based on colloidal gold and silver electrodeposition[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2009，138(1)：214-220

[38]Larou E，Yiakoumettis I，Kaltsas G，et al.High throughput cellular biosensor for the ultra-sensitive，ultra-rapid detection of aflatoxin M1[J].Food Control，2013，29(1)：208-212

[39]左伯莉，劉國宏.化學傳感器原理及應用[M].北京：清華大學出版社，2007：168

[40]Sapsford K E，Taitt C R，Fertig S，et al.Indirect competitive immunoassay for detection of aflatoxin B1in corn and nut products using the array biosensor[J].Biosensors and Bioelectronics，2006，21(12)：2298-2305

[41]Pohanka M，Kuca K，Jun D.Aflatoxin assay using an amperometric sensor strip and acetylcholinesterase as recognition element[J].Sensor Letters，2008，6(3)：450-453

[42]Maragos C M，Busman M.Rapid and advanced tools for mycotoxin analysis：a review[J].Food Additives & Contaminants：Part A，2010，27(5)：688-700

[43]Chen J H，Liu D L，Li S C，et al.Development of an amperometric enzyme electrode biosensor for sterigmatocystin detection[J].Enzyme and Microbial Technology，2010，47(4)：119-126

[44]Vidal J C，Bonel L，Ezquerra A，et al.Electrochemical affinity biosensors for detection of mycotoxins：A review[J].Biosensors and Bioelectronics，2013，49(1)：146-158

[45]Grieshaber D，MacKenzie R，V?r?s J，et al.Electrochemical biosensors-Sensor principles and architectures[J].Sensors，2008，8(3)：1400-1458

[46]Velusamy V，Arshak K，Korostynska O，et al.An overview of foodborne pathogen detection：In the perspective of biosensors[J].Biotechnology Advances，2010，28(2)：232-254.

Recent Developments and Applications of Electrochemical Biosensors for Aflatoxins Detection

Ma Haihua1，2，3，4Zhang Yuan1，4Zhen Tong3Sun Jizhou1Xia Shanhong1

(State Key Laboratory of Transducer Technology，Institute of Electronics，Chinese Academy of Sciences1，Beijing 100190)(Graduate University of Chinese Academy of Sciences2，Beijing 100080)(College of Information Science and Engineering，Henan University of Technology3，Zhengzhou 450001)(Key Laboratory of Grain Information Processing and Control of Ministry of Education4，Zhengzhou 450001)

Aflatoxins are produced as secondary metabolites by the fungiAspergillusflavusandAspergillusparasiticus，which are known to be potent toxic，carcinogenic，teratogenic and mutagenic.The intake of agriculture products and food contaminated by aflatoxins may significantly threaten to the health of human and animals.On the basis of the researches all over the world over the past decade，this review gives a general overview of development situations and application prospects of electrochemical biosensors in aflatoxins detection，focusing on the electrochemical sensing mechanisms，fabrication methods and detection performances.Compared with the traditional methods for detecting aflatoxins，electrochemical biosensors have the advantages of fast，simple，low-cost，easy of miniaturization and so on.The use of gold nanoparticles，carbon nanotubes and other nanomaterials will further increase the sensitivity of the electrochemical biosensors and the immobilization efficiency of the antigens or antibodies.Meanwhile，ultramicroelectrodes，sensor arrays and microfluidics will also improve the sensors’ performances for toxins detection.

aflatoxins，electrochemistry，biosensor，immunoassay，nanomaterial

O657.1；TP212.3

A

1003-0174(2016)02-0132-09

863計劃(2012AA101608)，國家自然科學基金(6140 1433)

2014-06-18

馬海華，女，1979年出生，講師，博士，生化微傳感器

張元，男，1961年出生，教授，博士生導師，智能信號處理與微系統技術