氣相色譜-質譜法測定橄欖油中8種脂肪酸含量

杜偉釗 盛靈慧 李保山 王 晶 向新乾 李秀琴

(北京化工大學1，北京 100029)(中國計量科學研究院2，北京 100029)

氣相色譜-質譜法測定橄欖油中8種脂肪酸含量

杜偉釗1，2盛靈慧2李保山1王 晶2向新乾1李秀琴2

(北京化工大學1，北京 100029)(中國計量科學研究院2，北京 100029)

基于同位素稀釋氣相色譜-質譜(GC-MS)建立了同時檢測橄欖油中8種脂肪酸的方法。對同位素內標物進行了篩選，確定了4種脂肪酸同位素標記物的組合模式。優化了酸堿結合法的樣品衍生化條件：含有適量同位素稀釋劑的8 mg橄欖油樣品中加入2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL，在80 ℃條件下皂化15 min。加入2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL，甲酯化10 min，隨后加入10 mL水終止反應。8種脂肪酸在0.02～1.6 μg/mL的濃度范圍內具有良好的線性，相關系數R2>0.99，定量限(S/N10)為0.07～0.54 μg/mL。本方法靈敏度高，測定結果準確可靠，可用于橄欖油中脂肪酸的測定。

橄欖油 氣相色譜-質譜 同位素稀釋 脂肪酸

橄欖油所含的不飽和脂肪酸最高可達88%，對人體具有多種保健作用[1-4]。由于橄欖樹種植困難，并且存在地域和環境等氣候限制以及壓榨工藝復雜等因素，造成了橄欖油價格的居高不下。高品質橄欖油的摻假是一種比較常見的欺詐行為。傳統的鑒別橄欖油優劣的方法主要是采取感官特征，但這種方法受到檢驗人員主觀因素的干擾。據報道顯示橄欖油中的脂肪酸組成可以有效的支撐橄欖油的質量評價,但脂肪酸含量的變化可能導致不同的判定結果,因此準確測定橄欖油的脂肪酸含量對于結果判定至關重要[5-7]。

目前關于脂肪酸的定量檢測主要以氣相色譜為主[8-11]，也有采用液相色譜質譜聯用法的報道，如Lerma-García等[11]采用液相色譜質譜法對橄欖油中的脂肪酸進行了測定。采用氣相色譜質譜聯用的方法，不僅涉及到脂肪酸的提取，同時需要對目標脂肪酸進行衍生化處理，樣品前處理不可避免的對測定結果造成一定影響。本研究在樣品前處理過程中通過引入目標脂肪酸的同位素標記物共同處理，消除了因為樣品的衍生化、轉移、定容等過程帶來的影響。針對樣品中不同豐度的脂肪酸采用分段檢測的方式，實現了橄欖油中脂肪酸的準確測定。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

四級桿氣相色譜質譜儀(配EI離子源)：美國賽默飛世爾公司；DK-8D型恒溫水浴槽：上海一恒科技有限公司；MTN-2800D型氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；xp56型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO；10、100、1 000 μL移液槍：德國eppendorf公司。

正己烷、甲醇：J&T baker；98%H2SO4、NaOH：北京化工廠；棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸、山崳酸標準物質：中國計量科學研究院；棕櫚酸同位素標記物(1-13C, 99%)、硬脂酸同位素標記物(1-13C, 99%)、油酸同位素標記物(1-13C, 99%)、花生酸同位素標記物(D39, 98%)：美國劍橋同位素標準品公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的配制

準確稱取棕櫚酸20 mg，油酸120 mg，亞油酸10 mg，加入10 mL甲醇溶解記為母液A；棕櫚油酸15 mg，硬脂酸45 mg，α-亞麻酸11 mg，花生酸5.6 mg，山崳酸3 mg，加入35 mL甲醇溶液溶解記為母液B；棕櫚酸同位素標記物20 mg，油酸同位素標記物120 mg，加入10 mL甲醇溶解記為母液C；硬脂酸同位素標記物60 mg，花生酸同位素標記物60 mg，加入35 mL甲醇溶解記為母液D；橄欖油樣品160 mg，加入2 mL正己烷溶解記為母液E。所有母液樣品在使用前均保存于-68 ℃冰箱保存，使用前平衡至室溫。

1.2.2 標準曲線溶液和樣本的配制

標準曲線溶液由母液A,B混合組成，使得曲線覆蓋范圍為樣品中目標脂肪酸含量的0.5～1.5倍(分別為0.5，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.5)，標準曲線各點中依次準確稱取等量的500 μL母液C和200 μL母液D，用作同位素內標。

樣品溶液由母液C，D，E混合組成，采用天平準確稱量500 μL母液C，200 μL母液D，200 μL母液E混合均勻即為含有同位素內標物的待測樣品。

1.2.3 樣品前處理

向配制好的標準曲線溶液或樣品溶液中加入2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL，80 ℃水浴回流皂化15 min，隨后加入濃度為2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL，回流甲酯化10 min，最后加入20 mL超純水中止反應，并將體系冷卻至室溫，用10 mL正己烷振蕩萃取。取上清液，氮氣揮干，用1 000 μL正己烷復溶后上機檢測。

1.2.4 GC-MS工作條件

氣相色譜質譜：thermo ISQ；色譜柱：Agilent DB-225 MS(60 m，0.250 mm，0.25 μm)；載氣：高純氦氣；升溫程序：柱溫箱初始溫度120 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min的速率升溫至195 ℃，保持20 min，以5 ℃/min的速率升溫至235 ℃，保持10 min；進樣口溫度：240 ℃；進樣量：1 μL。

電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：220 ℃；掃面范圍：35～400 amu。

2 結果與討論

2.1 皂化及甲酯化反應條件的優化

采用外標法對前處理過程中堿濃度(1%、2%、3%、4%)、皂化時間(10、15、20、25 min)、酸濃度(1%、2%、3%、4%)和甲酯化時間(2、5、10、15 min)分別進行單因素優化實驗，以橄欖油中含量較高的不飽和脂肪酸油酸作為優化指標，優化結果如圖1、圖2所示。可以看出油酸的甲酯化轉化率隨著各優化條件的上升均有所增加，但達到某一峰值后均呈不同程度的下降趨勢。可以發現堿濃度過高可能會過多的中和后續反應中的酸催化劑，因此降低了甲酯化效率；而皂化、甲酯化時間過長或是酸濃度過高均可能引發了副反應而降低了甲酯化效率。通過優化實驗得到1.2.3中的前處理條件。

圖1 堿濃度(a)和酸濃度(b)對甲酯化效率的影響

圖2 皂化時間(c)和甲酯化時間(d)對甲酯化效率的影響

2.2 同位素標記物和特征離子峰的選擇

為保證測定數據的準確性，考察了多種同位素標記物的出峰情況，發現當使用脂肪酸部分氘代標記物時，有可能會對目標脂肪酸本身造成干擾，影響色譜峰的對稱性。如圖3所示，C16∶0(2,2-D2)同位素標記物的加入使得棕櫚酸峰形受到影響，而C16∶0(1-13C)同位素標記物的加入可以避免此現象的發生，如圖4所示。同時當使用脂肪酸全氘代標記物時，同位素標記物的保留時間與目標脂肪酸的保留時間會出現偏移。如圖5所示，花生酸C20∶0(D39)同位素標記物的出峰時間比花生酸的出峰有所提前，但結果顯示保留時間不同并不會對測定結果產生影響。

圖3 棕櫚酸及其同位素標記物C16∶0(2,2-D2)色譜圖

圖4 棕櫚酸及其同位素標記物C16∶0(1-13C)色譜圖

圖5 花生酸及其同位素標記物C20∶0(D39)色譜圖

2.3 線性方程

試驗中，內標所用同位素標記物與橄欖油中同一脂肪酸摩爾比在1∶1左右，標準曲線覆蓋濃度范圍為目標脂肪酸的0.5～1.5倍。以脂肪酸與其對應脂肪酸同位素標記物在樣品中的摩爾比作為X軸，譜圖中的脂肪酸與同位素標記物的面積比為Y軸作圖，可獲得如圖6所示的標準曲線。

圖6 脂肪酸與同位素比標準曲線

圖6中RM為樣品中脂肪酸與其對應脂肪酸標記物的摩爾比；RA為樣品中脂肪酸與其對應脂肪酸標記物的出峰面積比；k與b分別為經過線性擬合所得標準曲線的斜率和截距。

8種脂肪酸的保留時間、特征離子、標準曲線方程見表1。通過分段檢測的方法，調整分流比及待測樣品濃度使不同含量的脂肪酸色譜峰信噪比(S/N)均在20以上，方法的檢出限(S/N=3)為0.02～1.6 μg/mL，定量限(S/N=10)為0.07～5.4 μg/ml。

表1 8種脂肪酸的保留時間、特征離子、標準曲線

2.4 方法驗證

準確稱量NIST 3274-1標準物質及脂肪酸同位素標記物，對棕櫚酸、棕櫚油酸等8種脂肪酸進行測定，考察該方法的準確性。測定過程與1.2.3和1.2.4條件相同。根據脂肪酸含量的不同，采取分段檢測的方法，將目標脂肪酸與其對應的脂肪酸同位素峰面積比值帶入各自的線性方程中，計算出各脂肪酸的含量。表2為NIST 3274-1標準物質標準值及方法驗證試驗的測試結果。

表2 NIST 3274-1標物中脂肪酸參考及實測含量

驗證試驗結果顯示該試驗方法具有良好的準確性，測定結果全部落在標準值的區間內。同時發現當采用自身同位素標記物測定某一脂肪酸含量時，數據將更為準確，但是由于脂肪酸同位素內標的價格昂貴并難于獲取等原因，在實際的檢測過程中無法實現全部采用自身同位素進行定量，試驗中通過采用碳數相近的脂肪酸同位素內標，同樣取得了準確的結果。

2.5 橄欖油樣品中脂肪酸的定量分析

準確稱量一定量的橄欖油及同位素標記物樣品，隨后按1.2.3的條件進行樣品前處理，按1.2.4的方法進行GC-MS分析，結果如表3所示。可以看出橄欖油中脂肪酸含量最高的為油酸，含量在741.71 mg/g左右，其次是棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸，含量分別在110.99，61.80和37.84 mg/g左右，其余4種脂肪酸(棕櫚油酸、α-亞麻酸、花生酸和山崳酸)含量均在1%以下，橄欖油中不飽和脂肪酸總量在80%以上。

表3 8種脂肪酸在橄欖油中的含量

3 結論

本試驗建立了橄欖油中8種常見脂肪酸的定量檢測方法，獲取的最佳皂化、甲酯化條件為：樣品8 mg，2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL皂化15 min，2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL甲酯化10 min。采用同位素稀釋質譜法可以實現橄欖油中8種脂肪酸的定量檢測。通過對NIST 3274-1標準物質同樣檢測方法的比對，可知本方法具有良好的準確性，可比性和可溯源性。

志謝：本項目得到了國家質檢總局食品安全項目“谷物、油脂類食品中脂肪酸、功能糖、蛋白過敏源標準物質研究”(32-ASPAQ1303)和質檢行業公益項目子課題“雙打中大豆油和橄欖油檢驗鑒定用標準物質研制”(32-211309GYH-2)的支持。

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Determination of Eight Fatty Acids in Olive Oil by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Du Weizhao1，2Sheng Linghui2Li Baoshan1Wang Jing2Xiang Xinqian1Li Xiuqin2

(Beijing University of Chemical Technology1, Beijing 100029)(National Institute of Metrology2, Beijing 100029)

An isotope dilution method for simultaneous determination of eight fatty acids in olive oil has been established along with the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in the paper. After comparison among different isotope labeled fatty acids, four fatty acids were selected to be the internal standards. The conditions of fatty acid methyl esters preparation were optimized. The final procedures were as follows: 8 mg of sample oil, saponificated in 2 mL of NaOH-CH3OH (2%) for 15 min; methyl esterificated by 10 mL of H2SO4-CH3OH (2%) for 10 min. The limits of quantification (LOQ), linearity and accuracy were validated finally. The LOQs for analytes were proved to range from 0.07～0.54 g/mL (S/N10); the determination coefficients>0.99 within the tested concentration range (0.02～1.6 g/mL). The established method shall be successfully applied in the determination of target fatty acids in olive oil.

olive oil, GC-MS, isotope dilution, fatty acid

TQ646.4

A

1003-0174(2016)04-0104-05

國家質量監督檢驗檢疫總局”雙打”項目子課題(21130SGYH-2)，中國計量科學研究院基本科研業務費(AKY1411-14)

2014-08-08

杜偉釗，男，1989年出生，碩士，化學工程與技術

盛靈慧，男，1978年出生，副研究員，脂質計量標準研究