油用牡丹籽餅粕中低聚茋類含量測定方法研究

劉 普 李小方 王永威 劉一瓊 鄧瑞雪

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術研究中心 河南科技大學化工與制藥學院，洛陽 471023)

油用牡丹籽餅粕中低聚茋類含量測定方法研究

劉 普 李小方 王永威 劉一瓊 鄧瑞雪

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術研究中心 河南科技大學化工與制藥學院，洛陽 471023)

采用Folin-Ciocalteus比色法測定油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的含量。以沒食子酸為標準物質，系統研究了Folin-Ciocalteus比色法測定油用牡丹籽餅粕中低聚茋類的方法。得到適宜的顯色條件為：顯色劑用量為5 mL，碳酸鈉溶液用量為15 mL，反應時間為30 min，反應溫度為20～25 ℃。根據低聚茋類化合物與Folin-Ciocalteus反應后的紫外可見光區的特征吸收，由光譜掃描曲線可知最大吸收波長為750 nm，通過繪制標準曲線，得到沒食子酸的濃度與吸光度之間的線性關系。研究結果表明：在0.5～3.5 μg/mL范圍內，沒食子酸吸光度與其質量呈良好線性關系，R2=0.999 6，平均加樣回收率99.8%，RSD為0.97%。該方法簡便、快速、穩定性好，可以用于低聚茋類化合物的含量測定。

Folin-Ciocalteus比色法 油用牡丹 籽餅粕 低聚茋類化合物

牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，包括亞油酸、亞麻酸和油酸，總不飽和脂肪酸含量可以達到90%以上[1-4]。此外，牡丹籽餅粕中還含有大量的多酚類活性物質—低聚茋類化合物[5]。低聚茋類化合物是一類具有1, 2-二苯乙烯骨架的聚合物的總稱。主要包括白藜蘆醇及其衍生物以同種或異種單體經脫氫后形成的聚合度不等且具有復雜結構的天然產物。近年來，隨著低聚茋類化合物數量的增多，因為其具有復雜的結構和良好抗真菌、抗細菌、抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病及保肝等多種生物活性[6-10]，備受研究者的關注。目前共有超過600種的低聚茋類化合物被分離得到。

目前測定多酚類常用的方法是Folin-Ciocalteu比色法，如茶葉中茶多酚的測定[11-12]，但茶多酚屬于黃酮類和類黃酮類(花色苷類)化合物，而油用牡丹中多酚為低聚茋類化合物。鮮有采用Folin-Ciocalteu比色法測定低聚茋類化合物含量研究的文獻報道。本研究通過Folin-Ciocalteu比色法對油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物含量的測定方法進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽餅粕：紫斑牡丹(P.rocki)通過不脫殼直接壓榨法榨油后的剩余部分，由洛陽全福食品有限公司提供；牡丹醇A (Suffruticosol A)：自制，純度>98%(HPLC)；鉬酸鈉：天津市化學試劑四廠；鎢酸鈉，無水碳酸鈉：天津市大茂化學試劑廠；磷酸，濃鹽酸，硫酸鋰：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

UV 2501-PC紫外-可見分光光度計：島津公司；RE-2000A旋轉蒸發器，SHZ-D(Ⅲ) 型循環水真空泵：河南省予華儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；HANGPNG FA2004電子天平：上海越平科學儀器有限公司；H-1650臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Folin-Ciocalteu試劑的配制[11-12]

將10 g鎢酸鈉、2.5 g鉬酸鈉、70 mL蒸餾水、50 mL 85%磷酸及10 mL濃鹽酸裝入帶回流裝置的200 mL圓底燒瓶中，充分混合，文火緩慢回流10 h，加入15 g硫酸鋰(Li2SO4)，5 mL蒸餾水及數滴液溴，然后將燒瓶內溶液開口煮15 min，以驅除過量的溴，冷至室溫后用容量瓶定容至100 mL，過濾。濾液呈微綠色。濾液酸度相當于2 moL/L HCl溶液。將其置于棕色試劑瓶內，冷藏保存，用前稀釋3倍。

1.3.2 沒食子酸溶液的配制

稱取0.5 g沒食子酸，用去離子水完全溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為5 mg/mL的沒食子酸溶液。分別移取0，1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 mL于100 mL容量瓶中，定容，分別配成0，0.05，0.1，0.15，0.25，0.35 mg/mL的沒食子酸標準溶液。

1.3.3 單體低聚茋類樣品的配制

稱取從牡丹籽中分離得到的低聚茋類化合物—牡丹醇A (Suffruticosol A) 86.0 mg，用去離子水完全溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.86 mg/mL的牡丹醇A溶液。取5 mL上述牡丹醇A溶液于100 mL容量瓶中，定容，配制成0.043 mg/mL的牡丹醇A溶液。

1.3.4 牡丹籽餅粕供試品的制備

稱取一定量的牡丹籽餅粕于潔凈離心管中，然后向離心管中加入一定量丙酮，超生震蕩提取25 min，然后在6 000 r/min轉速下離心10 min，然后將上清液轉移到燒瓶中，重復3次，將上清液均轉移至燒瓶中，在小于60 ℃條件下采用旋轉蒸發器減壓回收丙酮，得牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取物。稱取一定量的低聚茋類提取物，用蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，備用。

1.3.5 測定條件

1.3.5.1 測定波長的選擇

取沒食子酸溶液、牡丹醇A溶液和牡丹籽餅粕低聚茋類提取物溶液各1.0 mL，分別與60 mL蒸餾水、5 mL Folin-Ciocalteu試劑、20%Na2CO3溶液混合均勻并定容至100 mL，20～25 ℃ 避光放置30 min，以1.0 mL去離子水代替樣品作空白對照，用紫外-可見分光光度計在400～800 nm波長范圍內進行掃描，得到沒食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕低聚茋類提取物經顯色反應后的吸收光譜，以選擇標準物和比色測定的波長。

1.3.5.2 顯色時間和溫度的確定

將各比色試劑混合均勻后，20 ℃避光放置，每隔一段時間測定其吸光值，確定比色體系反應完全所需時間。測定在不同溫度下顯色反應后溶液的吸光值，以考察反應溫度對比色效果的影響。

1.3.5.3 試劑加入體積比對吸光度的影響

取沒食子酸酸溶液1.0 mL，加入60 mL蒸餾水，混勻后分別加入體積比20%的Na2CO3溶液，定容至100 mL，顯色后測定其吸光值，測定Folin-Ciocalteu試劑與堿溶液用量比對比色效果的影響，以確定Folin-Ciocalteu顯色劑與飽和Na2CO3溶液的比例。

1.3.6 測定方法

分別取一定量供試品溶液，用紫外-可見分光光度計在最大吸收波長出測定吸光度，帶入線性回歸方程，計算低聚茋類化合物的含量。

2 結果與討論

2.1 比色法條件的確定

2.1.1 比色波長的確定

低聚茋類化合物屬于多酚類物質，可以與Folin-Ciocalteu試劑反應后生成藍色的化合物，測定藍色化合物的吸收光譜，選擇最大吸收波長作為比色法測定的波長。圖1為沒食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕提取液經顯色反應后的吸收光譜。沒食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕低聚茋類提取物溶液與Folin-Ciocalteu試劑反應顯色后均在720～760 nm范圍內有一明顯吸收峰，選擇最大吸收峰750 nm作為檢測波長。由于沒食子酸與低聚茋類化合物在750 nm處具有相同的吸收峰，因此可以選擇沒食子酸作為對照品來測定低聚茋類化合物的含量。

圖1 樣品經顯色反應后的吸收光譜

2.1.2 顯色時間和溫度的確定

低聚茋類化合物與顯色劑反應需要一個過程，從圖2可知，30 min內吸光值增大，顯色反應迅速，反應液顏色變藍且藍色逐漸加深。30 min后吸光值增大很小，反應液顏色基本不變，表明顯色反應基本完全。因此，將30 min確定為比色法的反應時間。

圖2 吸光值隨反應時間變化

顯色反應溫度對顯色效果也有一定的影響，過低和過高均不利于低聚茋類化合物的顯色(圖3)。在低溫條件下，顯色反應緩慢，吸光值較小。隨著溫度提高，反應速度加快，吸光值也逐漸增大，至30 ℃時達到最大值。而在20～25 ℃范圍內吸光值穩定在0.337，與30 ℃時0.338并無太大差距。在20～30 ℃范圍內吸光度隨溫度變化在千分位，溫度影響并不太大。高溫條件下，反應顏色相對較淺，吸光值降低。這表明生成的藍色物質在高溫下不穩定，容易褪色，所以綜合考慮后本試驗確定顯色反應溫度為20～25 ℃。

圖3 吸光值隨反應溫度變化

2.1.3 試劑加入體積比對吸光度的影響

顯色劑與低聚茋類化合物須在堿性條件下才能顯色。顯色劑用量對顯色效果也有影響(圖4)，分別加1、2、3、3.5、4、4.5、5 mL顯色劑，以選擇最佳顯色效果。圖4反映顯色劑用量為5 mL最佳。

在顯色劑與堿體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5條件下確定堿用量。圖5反映出在1∶3時顯色效果最好，1∶4時顯色效果明顯較差。因此，確定顯色劑用量為5 mL，堿用量為15 mL (在100 mL容量瓶中顯色、定容)。

圖4 吸光值隨Folin-Ciocalteu試劑添加量的變化

圖5 吸光值隨20%Na2CO3溶液與顯色劑體積比的變化

2.2 標準曲線的建立

分別移取1.3.2中配置的沒食子酸標準溶液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入60 mL的水，混合后加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將標準溶液在20 ℃放置30 min后，在波長為750 nm下測定吸光值，繪制標準曲線。

對照品標準曲線如圖6所示，曲線的回歸方程為：y=0.094 3x+0.004 7，R2=0.999 6，式中：x為樣品質量濃度(μg/mL)；y為吸光度值。方程表明，標準品濃度在0.5～0.35 μg/mL的范圍內呈線性關系。

圖6 沒食子酸標準曲線

2.3 測定方法學評價

2.3.1 穩定性試驗

對Folin-Ciocalteu比色法測定牡丹籽餅粕低聚茋類化合物進行穩定性試驗，反應完全后在30 ℃下避光放置45、60、90、120、150 min后測定吸光值。隨著時間的延長，吸光值有下降趨勢，但幅度不大，RSD為0.325%，表明穩定性良好。

表1 穩定性試驗結果

2.3.2 精密度試驗

對Folin-Ciocalteu比色法測定牡丹籽餅粕低聚茋類化合物進行精密度試驗，同一樣品測定5次，其吸光值的RSD為1.6%，表明該方法具有較高的精密度，完全能滿足樣品分析的要求。

表2 精密度試驗結果

2.3.3 加標回收試驗

精密稱取6份已知低聚茋類化合物含量的牡丹籽餅粕提取物于離心管中，分別加入濃度為0.043 mg/mL的牡丹醇A溶液2.0，2.0，3.0，3.0，3.5，3.5 mL，然后按照1.3.4的方法配制供試品溶液。混合均勻后加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將上述溶液在20 ℃放置2 h后，在波長為750 nm下測定吸光值，由標準曲線計算低聚茋類化合物的含量，并計算其回收率和相對標準偏差，以評價該比色方法的準確度和可靠性。

表3 加樣回收率試驗結果

由表3可知，6次加標回收試驗的最低回收率為98.3%，最高回收率為101.3%，平均回收率為99.8%，其RSD為0.97%。結果表明，Folin-Ciocalteu比色法具有較高的準確性和可靠性，完全可用于牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物含量的測定。

2.4 測定牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物含量

采用上述方法，測定6批通過壓榨法制備的牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的含量，每個樣品平均測試3次，取平均值。測試結果見表4。

表4 不同批次測定結果

3 結論

牡丹籽油中低聚茋類化合物具有多酚類物質的性質，通過與Folin-Ciocalteu作用在750 nm處有最大吸收峰，可以采用Folin-Ciocalteu法測定天然產物中低聚茋類化合物的含量。Folin-Ciocalteu法測定牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物含量的條件為：顯色時間為120 min，顯色反應溫度為20 ℃，顯色劑用量為5 mL，堿用量為15 mL。

采用Folin-Ciocalteu法測定牡丹籽油這低聚茋類化合物含量，具有穩定性好、重現性好、精密度高的特點，加樣回收率可以達到99.8%。此方法簡便、快捷、穩定，可以用于牡丹籽油及其它樣品中低聚茋類化合物的含量測定。

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Test Methodology of the Content of Oligostilbenes in the Seed Cake of Peony for Oil

Liu Pu Li Xiaofang Wang Yongwei Liu Yiqiong Deng Ruixue

(Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source Chemical Engineering & pharmaceutical College,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023)

The experiment in the paper utilized Folin-Ciocalteu colorimetric method to determine the oligostilbenes in peony seed cake for oil. The gallic acid was applied as a reference substance and has been systematically investigated for the development of the optimal colorimetric method. The optimum colorimetric conditions were as follows: 5 mL of Folin-Ciocalteu reagent, 15 mL of 20% Na2CO3solution, reaction time for 30 min and reaction temperature at 20～25 ℃. On condition that the reaction of oligostilbenes and the Folin-Ciocalteu reagent had the characteristics of absorption at 400～900 nm UV-Vis, the spectral scanning curves was taken to determine the wavelength as 750 nm. By drawing standard curve, the significant linear relation between concentration of gallic acid and absorbance was obtained. The calibration curve for quantifying gallic acid exhibited a fine linearity in range of 0.5～3.5μg/mL (R2=0.999 6); the reaverage recoveries of gallic acid of 99.8% with a RSD of 0.97%, the results showed that the method is simple, fast, fine stability, and suitable for the determination of the oligostilbenes in the plant.

folin-ciocalteus colorimetry, peony for oil, peony seed cake, oligostilbenes

TS229

A

1003-0174(2016)04-0138-05

洛陽市科技攻關(1301052A,1401074A)，河南科技大學大學生訓練計劃(HG201501)，河南省重點科技攻關(152102110079)

2014-08-24

劉普，男，1978年出生，副教授，牡丹深加工的研究與開發

鄧瑞雪，女，1978年出生，副教授，功能活性天然產物及其全合成