文心蘭切花無病毒種苗組培快繁生產技術

韓松　王安石　陳施明　周慧　林明光

摘要：針對目前文心蘭工廠化育苗過程中種苗帶病毒比率偏高的突出問題，筆者于近幾年開展了文心蘭切花無病毒種苗組培快繁生產技術研究，在取得一定成功經驗的基礎上總結了一套文心蘭無病毒健康種苗工廠化生產的技術體系及其流程，為該切花健康種苗的組培快繁生產提供參考。

關鍵詞：文心蘭 切花 無病毒種苗 組織培養 快速繁殖

文心蘭是文心蘭屬（Oncidium）植物總稱，目前世界栽培的文心蘭切花品種不多，南茜及其變異品種仍為文心蘭主栽品種。由于品種間雜交不育和自交不親和，生產上所需的種苗主要通過組培快繁技術。組織培養技術在克隆親本植物性狀同時，也復制其親本單株所感染的病毒病。病毒病是文心蘭生產上重要病害，國內為害文心蘭的病毒主要是建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒，為系統性感染，使蘭株生長緩慢，葉片出現條紋、斑塊、壞疽或綠色分布不均的嵌紋病斑：花朵上也會出現色澤不均、畸形、或提早凋萎等病斑，嚴重影響植株生長勢、切花產量與品質，且這2種病毒通常在文心蘭上復合感染，造成更為嚴重的為害。文心蘭感染病毒初期并不表現明顯病癥，容易導致栽培者的疏忽，帶病毒的種苗在生產上使用極為普遍。據筆者于2014年對海南省各地文心蘭種植園采集的299個樣品檢測結果，發現其蘭株總帶毒率為28.1%，其中，攜帶建蘭花葉病毒率為13.7%，攜帶齒唇蘭環斑病毒率為17.1%，同時攜帶2種病毒的攜帶率為2.3%。種苗帶病毒嚴重影響后續的生長發育、開花品質和鮮切花產量。為解決文心蘭工廠化育苗過程中種苗帶病毒比率偏高的突出問題，筆者從2012年起開展了文心蘭切花無病毒種苗組培快繁生產技術的研究，并于2014年底生產出首批無病毒健康種苗在生產上推廣應用。

1.建立無病健康種苗快繁技術體系

1.1無病健康種苗驗證制度重要性

世界首次無病健康種苗驗證制度源自于1929年荷蘭輸往美國的郁金香種球，被美方以攜帶為害性病毒病被拒絕入境。20世紀30年代，荷蘭掌據了病毒檢測技術后，生產出健康無病毒種球作用繁殖用種源，由此，荷蘭政府推動郁金香種球品質驗證制度，真正全面增強其郁金香種球競爭力，使其成為全球第一大郁金香輸出國。文心蘭切花是臺灣省最大宗出口鮮切花品種，全省種植面積約200hm2，臺灣農委防檢局于2002年3月12日公告實施文心蘭無病毒種苗驗證制度，讓符合標準的種苗獲得官方驗證，提升了其品質與競爭力。應用健康種苗防治系統性病害，因其增產增收增效作用明顯已在生產上逐漸應用，我國健康種苗驗證制度目前仍以鼓勵性質，尚未立法全面強制執行，在文心蘭切花生產中宜效仿臺灣文心蘭驗證制度，著手建立適合我國產業需求的種苗驗證制度。

1.2無病健康種苗快繁的關鍵技術

無病毒種苗是未被病毒感染，或經人工處理去除病毒的植物苗株，病毒病是文心蘭栽培的重要病害，主要通過帶病種苗傳染，為了保證在文心蘭切花生產中應用無病毒苗株，需要建立主栽品種的無病毒母本園，由它提供親本外植體繁殖材料。并掌握快速、專一和敏感的病毒檢測方法，能快速高度專一地檢出存在微量的病原，在短時間內處理多個樣品，檢測多種病毒，且節約成本。健康種苗應用中，種苗生產速率必須高于栽培后病毒再感染速率，才能取代田間已感病植株，降低田間病原密度，達到延緩病害流行效果，因此種苗能否大量快速生產也是健康種苗應用能否成功關鍵。以文心蘭花梗芽作為外植體進行誘導增殖可在短時間內實現快速繁殖的目的。通常1株生長旺盛的文心蘭植株每年可萌生3～6支花梗，每支花梗平均有5個芽，可用于誘導的外植體有15～30個，切除花梗，母株生長不受影響，且外植體采摘和消毒方便。因此，花梗芽組培快繁技術對無病毒優良種苗快繁作用非常重要。

此外，必須完全掌握病毒傳播途徑及可能污染源傳播方式。為害文心蘭鮮切花生產的2種重要病毒CyMV和ORSV經由機械性傷口入侵植物體內，因其在細胞外可存活極長時間，甚至長達10年之久，為穩定性極高的傳性病毒，容易污染栽培環境、器具與人員，組織培養或田間栽培管理過程中，所有可能造成表面傷口的操作，包括接種、換盆、修剪、切花甚至植株葉片間摩擦，都可能是病毒入侵感染的途徑。在無病毒健康種苗繁殖過程，確保繁殖后代種苗不會再次受到病原感染，以確保健康種苗品質。同時在無病健康種苗應用到田間時，采取預防病毒傳染的栽培措施，延緩或避免健康種苗受病毒感染，充分發揮健康種苗作用。

1.3無病健康種苗組培快繁技術流程

無病健康種苗組培快繁技術體系包括無病毒母本園建立，病毒檢測技術和組培快繁技術3個部分，通過選擇優良性狀的親本蘭株，經過病毒檢測程序，測定無病毒感染后，進行組織培養快繁，生產大量組培分生苗。無病毒健康種苗繁殖流程詳見圖1。

2.無病毒母本園建立

2.1母本園的設施條件

母本園栽培種植適宜在具有遮雨、防蟲（防蟲網為100目）、移動式遮陽網和水簾風機或空調調節適合植株生長的隔離環境中。文心蘭最適宜生長的溫度為25～30℃。一般只能接受冬季的陽光直射，夏季遮光60%～70%，其他季節遮光40%。

2.2無病毒繁殖母株的保存

無病毒繁殖母株是從大田采集優良性狀或變異單株，經檢測確定不帶有CyMV和ORSV 2種病毒后作為繁殖母株進行保存。母本園內的所有無病毒繁殖母株應獨立編號，植株間不得相互接觸。若有特殊情況必須將未經病毒檢定之植株移入母本園，須單獨編號且不得與其他植株接觸，應盡速進行病毒檢測，無病毒感染者方準予長期留置母本園內保存。栽培期間若發現可疑植株應立即進行病毒檢測，檢測結果如確定為病毒感染者應立即將植株移出保存園，且原置放位置應進行消毒預防措施，方能再放置其他母株。移出過程中需絕對避免碰觸其他植株，最好以報紙包裹后再移動之。每半年進行1次例行母株病毒檢定，以掌握確實感染狀態。

2.3母本園的管理措施

母本園應嚴格管控人員出入，并嚴禁任何人為接觸植株造成感染機會。人員在對母株進行操作時，使用的工具應經消毒處理，單株單剪，隨株更換，不得重復使用。若有碰觸植株時，應配戴抽換式手套，且必須隨植株更換。母本園內應隨時保持整潔，植株殘體必須隨時清除，不得隨意遺棄。所使用盆缽、介質、器具及花梗固定用器材等應采用全新資材。應設置管理紀錄簿，仔細記錄母本編號、移入日期、存放位置及病蟲害防治措施等。

2.4母本園的消毒措施

場地及表面消毒以0.5%漂白水定期噴濕表面擦拭。人體常接觸部位，如門把、電器開關、澆水噴頭手把、掃帚手把等也應定期以0.5%漂白水擦拭。使用器材和工具根據實際情況，可參考張清安（1995）的4種消毒方法，擇一采用。一是干熱消毒法，利用烘箱在180℃至少維持1 h；二是濕熱消毒法，以沸水煮沸至少15 min；三是火焰消毒法，將工具上接觸過植物汁液的部位以火焰燒烤至少10～20 s；四是化學藥品消毒法，以3%氫氧化納或磷酸三鈉溶液浸漬至少1 min。

3.文心蘭病毒檢測技術

3.1采樣方法

取樣數量為大田栽培植物或組培苗抽取全部有癥狀疑似病株，無癥狀植株按其總數的3%～5%隨機抽樣，最低抽樣50株，不夠50株的全部抽取；組培母瓶抽取全部樣品。取樣部位為疑似病株，取有明顯癥狀葉片，無癥狀植株，取完全展開的淡綠期葉片。樣品采集時，用滅菌的手術剪剪取葉片1片置于封口袋中-20℃保存，最多存放7 d。

3.2繁殖母株的病毒檢測

從田間收集或引種的具有優良性狀的繁殖母株樣品采用雙抗體夾心法（DAS-ELISA）按照劉福秀等（2013）的方法檢測CymMV和ORSV。每個樣品設置2個重復。讀取405 nm的吸收值，參照Satu1a等（19860的方法，吸收值在陰性對照的2倍以上視為陽性。2種病毒的檢測結果均為陰性的樣品進入母本園待用，任一病毒檢測結果出現陽性均淘汰。此檢測方法快速、經濟，可準確檢測此2種病毒，能在很大程度上保證用于繁殖的母本植株不攜帶病毒。

3.3組培母瓶的病毒檢測

采用雙重反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測技術，參照劉福秀等（2014）的方法檢測組培母瓶的帶毒情況。擴增結果出現675 bp條帶視為CymMV陽性，出現524 bp條帶視為ORSV陽性。2種病毒的檢測結果均為陰性的組培瓶進入下一步擴繁操作，任一病毒檢測結果出現陽性均淘汰。該檢測技術可同時檢測2種病毒，其敏感度約為ELISA的1000倍以上，在陽性樣品總RNA稀釋10000倍后仍能檢測出病毒信號，且對部分經ELISA測定為陰性的樣品中仍可順利檢測到病毒信號。可保證生產出來的種苗不攜帶這2種病毒。

4.花梗芽無病毒組培快繁技術

4.1無病毒組培母瓶培養

組培母瓶培養根據王安石（2015）研究，以外形呈筍狀，花苞和分叉始露出花梗苞片，高約70cm和中部節位的花梗上的芽為最適宜外植體；用0.1%升汞消毒處理花梗芽的適宜時間為12 min；1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2mg/L為花梗芽最佳初代誘導培養基。以35～40 d為1個誘導培養周期，經1～3次轉接后約95%的花梗芽轉化為營養芽，把經過3次誘導所有獲得的營養芽，經RT-PCR病毒檢測技術確認無病毒后，以無病毒組培母瓶進行集中增殖培養。

4.2增殖培養

繼代培養以6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L為最佳激素組合；以溫度25℃和光照強度2500 Lx（光照時間10-12 h/d）的培養條件最為理想。以繼代培養基為MS+6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+椰子水100 mL/L。壯苗培養培養基為MS+香蕉漿50 g/L，生根培養基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉漿50 g/L。叢生芽培養以雙芽或三芽為單位個體進行轉接，每45 d為1個循環周期繼代轉接1次，原球莖培養25～30 d轉接1次，連續轉接不超過12代。株高在3.0 cm以下的小苗進行壯苗培養，壯苗培養周期為50～60 d。經壯苗培養株高達3.0 cm以上，有5～6片葉的小苗切分成獨立的植株進行生根培養，轉入12 cm×15 cm聚丙烯組培袋，每袋放置10株小苗，轉入500 mL玻璃瓶每瓶放置25株。

4.3出圃質量標準

經生根培養60 d后，達到以下質量標準時作為合格組培苗即可出廠：一是植株生長健壯、挺直，葉片舒展、從基部往上呈互生狀，有層次感，無玻璃化，無黃葉；二是培養基及材料無真菌和細菌污染；三是苗高8～12 cm，苗粗0.4～0.59 cm，葉片數7片以上，根5根以上。合格組培苗經健化培養240 d的生長情況見圖2。